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背景:间充质干细胞是具有自我更新能力和分化能力的组织细胞前体细胞,能够分化为一系列的间质细胞,包括成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和内皮细胞等。细胞治疗是再生医学发展的一个重要分支。越来越多的研究发现,间充质干细胞能够修复组织损伤,达到一定治疗效果。因此,间充质干细胞被视为天然组织工程材料的重要种子细胞,具有广阔的应用前景。此外,间充质干细胞具有负性免疫调节能力。在体外共培养条件下,间充质干细胞能够抑制免疫细胞功能,包括抑制T细胞反应,抑制树突状细胞的成熟和抗原提成,抑制B细胞激活和增殖,降低自然杀伤(natural killer,NK)细胞的增殖和毒性,促进调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)生成等。但是由于间充质干细胞在体内比例很小,获取难度较大,体内间充质干细胞的数量不能满足临床治疗的需求。多能诱导干细胞是体细胞经过重编程技术得来的细胞,在功能上类似于胚胎干细胞。多能诱导干细胞分化成的间充质干细胞可能弥补间充质干细胞供应不足这一缺陷。研究报道,诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(induced pluripotent stem cell derived mesenchymal stem cell,iPS-MSC)在体外也能够抑制 NK 细胞的毒性,并且iPS-MSC和胚胎干细胞来源的间充质干细胞(enbryonic stem cell derived mesenchymal stem cell,ES-MSC)比骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)在拮抗NK细胞的激活上具有更好的效果。CD4+T细胞能够分化为一系列的细胞亚群保护机体免受病原体伤害,包括辅助性T细胞1(T helper1)和辅助性T细胞2(T helper 2)。研究发现,在体外共培养体系中,间充质干细胞能够抑制Th1细胞的伽马干扰素(IFN-γ)分泌,促进Th2细胞的白细胞介素4(interleokin4,IL-4)释放。但是,由于缺乏一个有效的实验动物模型,目前对间充质干细胞在体内的免疫调节能力和机制还知之甚少。capspase在T细胞内稳态和T细胞介导的免疫反应方面发挥了关键的作用。抑制caspase8的活性伴随着T细胞存活的减少。因此caspase可能在间充质干细胞抑制T细胞免疫应答这一过程中发挥了一定的作用。研究内容和方法:1)实验动物模型构建。本课题借鉴了胰岛移植模型,构建了小鼠肾被膜下细胞移植模型,共分四组:a)空白对照组,移植等体积的PBS,对小鼠造成相同的手术创伤;b)内皮细胞(HUVEC)移植组,内皮细胞是细胞免疫排斥的首要靶点,在本课题中作为阳性对照;c)iPS-MSC移植组,处理方法与b组一致;d)内皮细胞和间充质干细胞联合移植组(Co-grafts)(HUVEC:iPS-MSC=1:1),移植的总细胞数和b、c组一致,但是内皮细胞和间充质干细胞各自减半后混合。2)组织病理检测。移植一周后利用HE染色技术和激光共聚焦技术分别检测受体移植部位免疫细胞浸润情况和移植细胞的存活情况。3)T细胞亚群检测。通过流式细胞术检测受体小鼠脾脏内T细胞整体比例变化,以及Th1、Th2和Treg细胞整体比例变化;将T细胞分离纯化与体外内皮细胞和间充质干细胞共培养,检测T细胞群体比例改变。4)PCR技术和ELISA技术检测脾脏组织炎性因子改变。5)淋巴细胞增殖检测。分离受体小鼠脾脏细胞进行体外培养,利用BrdU和MTT技术检测脾细胞的增殖能力;将分离纯化的T细胞在体外与内皮细胞、干细胞共培养,BrdU检测T细胞的增殖能力;将T细胞培养在内皮细胞和间充质干细胞的培养上清中,检测T细胞的增殖能力;6)抗体芯片检测。利用抗体芯片技术检测内皮细胞和间充质干细胞的代谢组学,并进行Go oncology分析。7)受体小鼠脾脏信号通路检测。利用western blot技术检测受体小鼠脾脏组织半胱天冬酶(caspase)信号通路的改变,并利用信号通路抑制剂验·证该信号通路参与免疫应答的可能性。结果:与HUVEC移植组相比较,1)间充质干细胞组移植组显著地抑制了炎症细胞浸润,并且在肾被膜下可以更好地存活;2)间充质干细胞移植减少了脾脏内T细胞亚群比例,减少了 Th1、Th2细胞亚群比例,增加调节性T细胞的数量;3)体外共培养结果显示,间充质干细胞抑制T细胞群体内Th1、Th2的比例;4)间充质干细胞抑制了体内脾细胞的增殖;间充质干细胞及其培养上清抑制了体外T细胞的增殖5)间充质干细胞移植降低了脾细胞内和血清中细胞因子IL-2、IL-4的表达,促进抑制性细胞因子IL-10、TGF-β的表达。6)抗体芯片检测显示间充质干细胞高表达和分泌276种可溶性因子,包括IL-10、TGF-β、TSG-6等已报道的免疫调节因子。Go oncology分析显示其中137种富集在免疫系统进程(immune system process),51种富集在细胞因子产生(cytokineproduction),参与了淋巴细胞调控。7)信号通路检测显示,间充质干细胞移植减低了脾脏内caspase3,caspase8,PARP的活性。体外抑制caspase3和总的caspase活性能够抑制ConA诱导的T细胞增殖;体外TGF-β刺激抑制ConA诱导的脾细胞和T细胞增殖,抑制Th1和Th2亚群比例,失活caspase 3,激活caspase 8和PARP。结论:1)间充质干细胞移植能够抑制免疫细胞浸润;2)间充质干细胞移植抑制促炎性细胞因子表达和释放,促进抑炎性因子表达和释放;3)间充质干细胞移植能够通过旁分泌形式抑制辅助性T细胞群体比例,负性调控T细胞介导的免疫应答;4)间充质干细胞能够表达和分泌大量的可溶性因子调控免疫应答;5)间充质干细胞移植通过或部分通过失活caspase 3,caspase 8和PARP方式抑制小鼠脾脏免疫应答;6)体外TGF-β刺激能够抑制ConA诱导的脾细胞和T细胞增殖,抑制.Th1和Th2群体比例,失活caspase 3,但激活caspase 8和PARP。由此表明,间充质干细胞移植不完全通过分泌TGF-β调控小鼠脾脏免疫应答。