研究背景与目的鼻咽癌是中国南方常见的恶性肿瘤,放疗、化疗是治疗的主要手段。早期患者通过单纯放疗可达到根治;晚期患者采用了多种方式的放、化疗联合治疗,甚至高剂量化疗联合造血干细胞移植,虽然提高了局部控制率,但远处转移并未明显减少,严重影响了患者的生存。因此,急需寻找新的方法提高晚期鼻咽癌患者的治愈率。放、化疗与单克隆抗体结合可以提高治疗效果,探讨不同形式的生物治疗联合常规治疗成为新的研究方向。异基因造血干细胞移植中,同种异体反应性自然杀伤(Allo-reactive NaturalKiller,Allo-NK)细胞有提升恶性血液病治愈率的作用。最近研究显示,Allo-NK细胞对恶性黑色素瘤、肾癌、肠癌和卵巢癌细胞也有杀伤作用。但是,Allo-NK细胞对鼻咽癌细胞的作用尚待研究。NK细胞是遗传性免疫系统的主要效应细胞,对病源感染和转化了的细胞具有自然细胞毒效应,NK细胞表达的受体与靶细胞表面的配体通过遗传模式识别发挥效应。NK细胞杀伤靶细胞受HLA-KIR等抑制性信号和NKG2D配体-NKG2D等活化性信号共同调节。最新研究发现,NK细胞与肿瘤细胞接触后不是简单的杀伤和被杀伤的关系,而是出现了相互间的免疫编辑(Immunoediting),导致双方配-受体分子和生物学行为的改变。对免疫编辑相关分子的调节,可以改变双方相互反应的状态。但是,不同组织来源的肿瘤与Allo-NK细胞的编辑和调节反应是不一样的。依据鼻咽癌的起源、病因、发病机理、生物学行为和对NK细胞功能的揭示,我们认为Allo-NK细胞将会对鼻咽癌产生免疫反应。本研究以人鼻咽癌细胞CNE2和Allo-NK细胞混合培养为反应体系,探讨:①Allo-NK细胞能否杀伤CNE2细胞;②两者之间是否存在相互编辑,生物学行为改变和相关的分子基础;③能否对此过程进行调控,提高Allo-NK细胞的杀伤活性和CNE2细胞对杀伤的敏感性。本研究旨在揭示人鼻咽癌细胞和Allo-NK细胞相互反应的关系,并为遗传指导下过继性免疫化疗方案的建立提供理论和实验依据。实验方法第一章CNE2和K562细胞KIR配体和NKG2D配体的检测用QIAamp DNA抽提试剂提取CNE2和K562细胞的DNA;CNE2细胞的HLA基因型检测采用序列特异性引物扩增法(Sequence specific primer polymerasechain reproduction,PCR-SSP)。RT-PCR测定NK细胞的主要活化性受体NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3在CNE2和K562细胞mRNA水平的表达。流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测CNE2和K562细胞表面KIR配体HLA-I类分子和NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达状态。第二章Allo-NK细胞对CNE2和K562细胞的体外杀伤活性检测采集3例健康志愿者静脉血,分离单个核细胞,抽提DNA,NK细胞的KIR基因型分析采用PCR-SSP法;用抗CD56抗体免疫磁珠法纯化出NK细胞,体外IL-2培养24h,LDH释放法检测不同效靶比时其对CNE2和K562细胞的杀伤率。设定效靶比20:1,用不同的单抗分别封闭靶细胞表面NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3和KIR配体HLA-I类分子,观察NK细胞杀伤活性的变化。第三章Allo-NK细胞与CNE2和K562细胞间免疫编辑的体外实验3.1 Allo-NK细胞与CNE2细胞间的免疫编辑用抗CD56抗体免疫磁珠纯化3例健康志愿者的NK细胞,分为编辑前NK细胞组(100U/ml IL-2培养的NK细胞)、编辑后组(NK细胞与CNE2细胞10:1混合,加入100U/ml IL-2)。FCM检测培养不同时间点的NK细胞受体KIR、NKG2D的表达,编辑前、后的CNE2细胞表面HLA-I类分子和MICA/MICB、ULBP2的表达。LDH释放法测定编辑前、后的NK细胞对编辑前CNE2细胞的杀伤活性及编辑前NK细胞对编辑后CNE2细胞的杀伤活性。3.2 Allo-NK细胞与K562细胞间的免疫编辑NK细胞与K562细胞1:1混合培养24h,FCM检测编辑前、后K562细胞表面MICA/MICB的表达,NK细胞受体KIR2DL1、KIR3DL1和NKG2D的表达。LDH释放法测定编辑前、后NK细胞的杀伤活性。第四章对Allo-NK细胞与CNE2细胞生物学行为的调节4.1阻断抑制性KIR-HLA信号通路对Allo-NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响(1)阻断抑制性KIR-HLA信号通路对编辑前NK细胞杀伤编辑后CNE2细胞活性的影响设定效靶比20:1,单克隆抗体分别阻断编辑前NK细胞抑制性KIR和阻断编辑后CNE2细胞表面的KIR配体HLA-I类分子后,LDH释放法测定编辑前NK细胞对编辑后CNE2细胞杀伤活性的变化。(2)阻断抑制性KIR-HLA信号通路对编辑后NK细胞杀伤编辑前CNE2细胞活性的影响设定效靶比20:1,单克隆抗体分别阻断编辑后NK细胞表面不同的抑制性KIR分子和编辑前CNE2细胞表面的KIR配体HLA-I类分子后,LDH释放法测定编辑后NK细胞对编辑前CNE2细胞杀伤活性的变化。4.2调节活化性NKG2DL-NKG2D信号通路对Allo-NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响(1)rhIL-2、rhIL-15对编辑后NK细胞表面NKG2D表达和对Allo-NK细胞杀伤活性的影响抗CD56磁珠纯化NK细胞后分为4组:①编辑前NK细胞组:加入含100U/ml IL-2的培养基;②单纯编辑组:NK细胞与CNE2细胞10:1混合,加入含100U/ml IL-2的培养基;③IL-2再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入含1000U/ml IL-2的培养基;④IL-15再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入含10ng/ml IL-15的培养基。培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640。以上细胞培养24h后FCM检测各组NK细胞表面活化性受体NKG2D的表达;LDH释放法测定各组NK细胞对编辑前、后CNE2细胞的杀伤活性。(2)顺铂(DDP)对编辑前、后CNE2细胞表面的NKG2D配体表达和对NK细胞杀伤敏感性的影响编辑前、后CNE2细胞以1×10~5/ml的浓度接种于24孔培养板,加入2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml DDP,以不加药物组做对照,培养24h后,观察DDP对编辑前、后CNE2细胞表面的MICA/MICB、ULBP2分子表达的影响。LDH释放法测定DDP作用前、后的CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异。(3)5-氟尿嘧啶(5-Fu)对编辑前、后CNE2细胞表面NKG2D配体表达和对NK细胞杀伤敏感性的影响编辑前、后CNE2细胞以1×10~5/ml的浓度接种于24孔培养板,以5μM的5-Fu加入培养基中,以不加药物组做对照,培养24h后,观察5-Fu对编辑前、后CNE2细胞表面MICA/MICB、ULBP2表达的影响。LDH释放法测定5-Fu作用前、后的CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异。统计学方法本实验数据应用SPSS13.0统计软件进行处理,以均值±标准差((?)±S)表示,所用统计方法主要包括独立样本t检验、单向方差分析、重复测量数据方差分析,以P＜0.05表示差异有统计学意义。结果第一章CNE2细胞和K562细胞KIR配体和NKG2D配体的表达1 CNE2细胞KIR配体HLA-I类分子基因型CNE2细胞HLA-I类分子基因型为A2、24,B18、35,Cw4、7。结果显示CNE2细胞为HLA-C1、C2同种异型。2 CNE2、K562细胞NKG2D配体在mRNA水平的表达CNE2、K562细胞在mRNA水平均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。3 CNE2、K562细胞KIR配体和NKG2D配体在蛋白水平的表达CNE2细胞表面表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP2分子,不表达ULBP1、ULBP3分子;表达HLA-I类分子。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3分子;不表达HLA-I类分子。结果显示,CNE2细胞表达有2个与NK细胞KIR结合的配体,有3个与NKG2D结合的配体;K562细胞不表达与NK细胞KIR结合的配体,有5个与NKG2D结合的配体。第二章Allo-NK细胞对CNE2、K562细胞体外杀伤试验1 Allo-NK细胞的KIR基因型3例健康志愿者的KIR基因型均为KIR2DL1,KIR2DL3,KIR3DL1,KIR3DL2,均为KIR A型。结果显示,KIR3DL1、KIR3DL2与CNE2细胞表面相应的HLA-A、B类分子间存在错配。2 Allo-NK细胞杀伤活性Allo-NK细胞对CNE2、K562细胞的杀伤活性随着效靶比升高而增强。在各效靶比时,NK细胞对CNE2、K562细胞杀伤活性的差异有统计学意义(t=16.136,P=0.000;t=15.909,P=0.000;t=10.622,P=0.006;t=10.349,P=0.000)。在效靶比20:1时,用AMO-1、BMO-1、M310分别对CNE2细胞表面NKG2D相应的配体MICA、MICB、ULBP2分子进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(26.59±3.85)%、(26.80±3.71)%、(26.75±3.68)%,与阻断前(35.74±3.59)%相比差异有统计学意义(P=0.007、P=0.008、P=0.007)。用M295、M551对CNE2细胞表面NKG2D相应配体ULBP1、ULBP3分子进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.81±4.23)%、(36.08±3.33)%,与阻断前相比差异无统计学意义(P=0.982、P=0.907)。用单克隆抗体AMO-1、BMO-1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面NKG2D相应配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3分子进行封闭,NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为(46.21±3.29)%、(49.33±0.90)%、(51.08±2.19)%、(51.04±1.62)%、(52.11±1.71)%,与阻断前(58.37±0.87)%相比差异有统计学意义(P=0.000、P=0.000、P=0.001、P=0.001、P=0.002)。用W632抗体对CNE2细胞表面的HLA-I类分子进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性为(54.27±1.64)%,与阻断前(35.74±3.59)%相比差异有统计学意义(P=0.000)。结果显示,NKG2DL-NKG2D、HLA-KIR两个信号通路共同调节Allo-NK细胞对CNE2细胞的杀伤,CNE2细胞为NK细胞杀伤的中度敏感株;仅NKG2DL-NKG2D一个活化信号通路调节NK细胞对K562细胞的杀伤,无抑制性信号通路调节,K562细胞为NK细胞杀伤的高度敏感株。第三章Allo-NK细胞与CNE2和K562细胞之间免疫编辑的体外实验3.1 Allo-NK细胞与CNE2细胞间的免疫编辑(1)编辑前、后NK细胞表面KIR及NKG2D的变化编辑前NK细胞组和编辑后组不同时间点KIR、NKG2D的表达率经重复测量数据的方差分析,两组NK细胞KIR2DL1、KIR2DL3、NKG2D表达率组间比较差异有统计学意义(F=27.176,P=0.006;F=439.932,P=0.000;F=8635.791,P=0.000);不同时间点,KIR2DL1、KIR2DL3、NKG2D表达率组间比较差异有统计学意义(F=2.013,P=0.001;F=13.799,P=0.000;F=1145.111,P=0.000)。两组NK细胞KIR3DL1表达率差异无统计学意义(F=0.305,P=0.610),不同时间点表达率差异无统计学意义(F=0.185,P=0.905)。结果显示,编辑后NK细胞的抑制性KIR2DL1、KIR2DL3表达上升,活化性受体NKG2D表达下降。(2)编辑前、后CNE2细胞表达的KIR配体和NKG2D配体的变化编辑前、后CNE2细胞表面HLA-I类分子的表达率分别为(99.77±0.12)%,(97.80±0.87)%,两者相比差异无统计学意义(t=3.874,P=0.057);MICA/MICB的表达率分别为(88.67±2.81)%,(34.53±3.15)%,两者相比差异有统计学意义(t=22.195,P=0.000)。ULBP2的表达分别为(50.03±1.95)%,(46.67±1.06)%,两者相比差异无统计学意义(t=2.627,P=0.058)。结果显示,编辑后CNE2细胞的MICA/MICB明显下降,HLA-I类分子、ULBP2表达无变化。(3)编辑前、后NK细胞对CNE2细胞杀伤活性变化编辑前、后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10:1时分别为(28.08±1.79)%、(2.74±1.64)%,两者相比差异有统计学意义(t=18.081,P=0.000);效靶比20:1时分别为(36.64±3.55)%、(4.57±2.41)%,两者相比差异有统计学意义(t=12.945,P=0.000)。结果说明,编辑后NK细胞的杀伤活性明显下降。(4)编辑前、后CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化NK细胞对编辑前、后CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10:1时分别为(28.08±1.79)%、(6.60±0.86)%,两者相比差异有统计学意义(t=18.741,P=0.000),效靶比20:1时分别为(36.64±3.55)%、(11.57±2.02)%,两者相比差异有统计学意义(t=10.642,P=0.000)。结果显示,编辑后的CNE2细胞对NK细胞杀伤的敏感性下降。3.2 Allo-NK细胞与K562细胞间的免疫编辑(1)编辑前、后NK细胞表面KIR及NKG2D的变化编辑前、后KIR2DL1的表达率分别为(45.70±1.22)%、(47.20±1.08)%,两者相比差异无统计学意义(t=1.596,P=0.186),KIR3DL1的表达率分别为(35.60±1.35)%、(34.03±1.20)%,两者相比差异无统计学意义(t=1.504,P=0.207);编辑前、后NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(98.27±0.67)%、(34.67±3.88)%,两者相比差异有统计学意义(t=27.974,P=0.000)。结果说明,编辑后NK细胞的NKG2D表达明显下降,KIR表达无变化。(2)编辑前、后K562细胞表达的NKG2D配体MICA/MICB的变化编辑前、后K562细胞MICA/MICB的表达率分别为(79.90±0.87)%、(35.56±1.01)%,两者相比差异有统计学意义(t=57.724,P=0.000)。结果说明,编辑后K562细胞的NKG2D配体MICA/MICB表达明显降低。(3)编辑前、后NK细胞对K562细胞杀伤活性的变化效靶比20:1时,编辑后NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(16.95±2.00)%,与编辑前的NK细胞杀伤活性(52.34±2.22)%相比差异有统计学意义(P=0.000)。结果显示,编辑后的NK细胞杀伤活性明显下降。(4)编辑前、后K562细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化效靶比20:1时,NK细胞对编辑前、后K562细胞的杀伤活性分别为(52.34±2.22)%、(24.07±0.58)%,两者相比差异有统计学意义(P=0.000)。结果显示,编辑后的K562细胞对NK细胞杀伤的敏感性明显降低。第四章对Allo-NK细胞与CNE2细胞生物学行为的调节4.1阻断抑制性KIR-HLA信号通路对Allo-NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响(1)阻断抑制性KIR-HLA信号通路对编辑前NK细胞杀伤编辑后CNE2细胞活性的影响效靶比20:1时,EB6b(anti-KIR2DL1)、GL183(anti-KIR2DL2/3)阻断编辑前的NK细胞,其对编辑后CNE2的杀伤活性分别为(19.70±1.50)%、(21.20±1.43)%,与阻断前(12.23±1.75)%相比差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。Z27(anti-KIR3DL1)阻断编辑前NK细胞,其对编辑后的CNE2杀伤活性为(12.61±1.06)%,与编辑前(12.23±1.75)%相比差异无统计学意义(P=0.782)。W632阻断编辑后CNE2细胞表面的HLA-I类分子,编辑前的NK细胞对其杀伤活性为(37.38±2.11)%,与阻断前相比(12.23±1.75)%差异有统计学意义(P=0.000)。说明阻断KIR-HLA信号系统的受体或配体可提高编辑前NK细胞的杀伤活性。(2)阻断抑制性KIR-HLA信号通路对编辑后NK细胞杀伤编辑前CNE2细胞活性的影响效靶比20:1时,EB6b(anti-KIR2DL1)、GL183(anti-KIR2DL2/3)阻断编辑后的NK细胞,其对编辑前CNE2细胞杀伤活性分别为(20.92±2.97)%、(19.52±0.84)%,与阻断前(4.70±1.44)%相比差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。Z27(anti-KIR3DL1)阻断编辑后的NK细胞,其对编辑前CNE2细胞杀伤活性为(4.94±2.36)%,与编辑前(4.70±1.44)%相比差异无统计学意义(P=0.891)。W632阻断编辑前CNE2细胞表面的HLA-I类分子,编辑后的NK细胞对其杀伤活性为(33.54±2.18)%,与阻断前(4.70±1.44)%相比差异有统计学意义(P=0.000)。结果显示,阻断KIR-HLA信号系统的配体或受体可提高编辑后NK细胞的杀伤活性。4.2调节活化性NKG2DL-NKG2D信号通路对Allo-NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响(1)rhIL-2、rhIL-15对编辑后NK细胞表面NKG2D表达和对Allo-NK细胞杀伤活性的影响编辑前NK细胞组、单纯编辑组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(97.63±0.83)%、(53.50±1.25)%、(94.47±1.00)%、(98.07±0.21)%,经单向方差分析结果显示,组间差异有统计学意义(F=1702.532,P=0.000)。IL-2、IL-15再培养组分别与单纯编辑组相比差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000),IL-2再培养组与IL-15再培养组相比差异有统计学意义(P=0.001),IL-15再培养组与编辑前NK细胞组相比差异无统计学意义(P=0.743)。结果显示,高剂量IL-2、IL-15可以上调编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,IL-15的作用较IL-2强。编辑前NK细胞、单纯编辑组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞对编辑前CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.90±3.27)%、(4.70±2.30)%、(31.70±3.56)%、(40.18±2.94)%,组间比较差异有统计学意义(F=85.253,P=0.000)。IL-2再培养组、IL-15再培养组分别与编辑前NK细胞组相比差异无统计学意义(P=0.131,P=0.124),IL-2再培养组与IL-15再培养组相比差异有统计学意义(P=0.009)。说明高剂量IL-2、IL-15可恢复编辑后NK细胞对编辑前CNE2细胞的杀伤活性,IL-15的作用较IL-2强。编辑前NK细胞组、IL-2再培养组、IL-15再培养组、单纯编辑组NK细胞对编辑后CNE2细胞的杀伤活性分别为(11.41±2.02)%、(10.43±1.21)%、(12.10±1.93)%、(0.49±0.05)%,经单向方差分析显示,组间差异有统计学意义(F=60.799,P=0.000);编辑前NK细胞组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞的杀伤活性与单纯编辑组NK细胞相比,差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000);编辑前NK细胞组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞杀伤活性对比,组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结果说明,高剂量IL-2、IL-15可恢复编辑后NK细胞对编辑后CNE2细胞的杀伤活性。(2)DDP对编辑前、后CNE2细胞表面NKG2D配体表达及其对NK细胞杀伤敏感性的影响。编辑前CNE2细胞经0μg/ml(对照组)、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的DDP作用后,细胞表面MICA/MICB的表达率分别为(87.47±1.80)%、(96.20±1.42)%、(96.93±1.33)%、(96.50±1.10)%,单向方差分析显示组间差异有统计学意义(F=30.146、P=0.000);2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的DDP作用组与对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。编辑后CNE2细胞经0μg/ml(对照组)、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的DDP作用后,细胞表面MICA/MICB的表达率分别为(35.20±2.00)%、(47.77±7.82)%、(58.07±1.92)%、(55.97±2.62)%,组间比较差异有统计学意义(F=17.027、P=0.001);2.5μg/ml的DDP作用组与对照组对比差异无统计学意义(P＞0.05),5μg/ml、10μg/ml的DDP作用组与对照组对比差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.05)。编辑前、后的CNE2细胞经0μg/ml(对照组)、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的DDP作用后细胞表面ULBP2的表达,组间差异均无统计学意义(F=3.231,P=0.082;F=0.571,P=0.650)。结果说明,DDP可以上调编辑前、后CNE2细胞的MICA/MICB表达,但对ULBP2的表达无影响。效靶比20:1时,NK细胞对编辑前、后CNE2细胞的杀伤活性分别为(38.11±1.41)%、(10.69±2.81)%;对5μg/ml DDP刺激后的编辑前、后CNE2细胞的杀伤活性分别为(47.71±1.53)%、(19.84±2.87)%,与DDP刺激前相比差异有统计学意义(P=0.001,P=0.017)。结果说明,DDP可以提升CNE2细胞对NK细胞杀伤的敏感性。(3)5-Fu对编辑前、后CNE2细胞表面NKG2D配体表达及其对NK细胞杀伤敏感性的影响编辑前CNE2细胞经5μM 5-Fu作用24h后,细胞表面MICA/MICB的表达率为(85.70±1.05)%,与作用前(87.47±1.80)%相比差异无统计学意义(t=1.467,P=0.216);ULBP2表达率为(68.00±0.50)%,与作用前(47.40±0.66)%相比差异有统计学意义(t=43.269,P=0.000)。编辑后CNE2细胞经5μM 5-Fu作用24h后,细胞表面MICA/MICB表达率为(34.93±1.63)%,与作用前(35.20±2.00)%相比差异无统计学意义(t=0.179,P=0.866);ULBP2表达率为(62.43±1.72)%,与作用前(45.83±1.33)%相比差异有统计学意义(t=13.197,P=0.000)。结果说明,5-Fu可提高编辑前、后CNE2细胞表面ULBP2的表达,对MICA/MICB表达无影响。效靶比20:1时,NK细胞对5-Fu作用前、后的编辑前CNE2细胞杀伤活性分别为(38.11±1.41)%、(51.25±3.71)%,两者相比差异有统计学意义(t=5.740,P=0.005);NK细胞对5-Fu作用前、后的编辑后CNE2细胞杀伤活性分别为(10.69±2.81)%、(24.38±4.28)%,两者相比差异有统计学意义(t=4.629,P=0.01)。结果说明,5-Fu可以增强编辑前、后CNE2细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结论1鼻咽癌细胞CNE2表达与NK细胞抑制性KIR相结合的HLA-C1、C2同种异型分子和与NKG2D活化受体相结合的MICA、MICB和ULBP2分子,抑制性和活化性两个信号系统共同参与对Allo-NK细胞毒活性的调节,导致CNE2细胞对Allo-NK细胞杀伤中度敏感。白血病细胞K562不表达与NK细胞抑制性KIR相结合的HLA-I类分子,表达有5个与NKG2D受体相结合的MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3分子,只有活化性信号系统参与对NK细胞杀伤调节,缺乏抑制性信号,使K562细胞对Allo-NK细胞杀伤高度敏感。2 CNE2细胞和K562细胞与Allo-NK细胞接触后存在着相互间的免疫编辑,表现为NK细胞的杀伤活性下降,CNE2和K562细胞出现对NK细胞杀伤敏感性下降。相关分子基础是NK细胞活化性受体NKG2D表达下降,抑制性KIR表达增高,呈现出NK细胞对肿瘤的自然杀伤是一次性机会杀伤(one shotkilling)。CNE2、K562细胞的NKG2D配体表达下降,肿瘤细胞处于对NK细胞的低激发状态和出现对杀伤的抵抗。相互编辑的分子基础是HLA-KIR和NKG2DL-NKG2D两个信号系统交互反应式的和配-受体特异性的。3高剂量IL-2、IL-15可以增加被编辑NK细胞NKG2D的表达、恢复其细胞毒活性。DDP、5-Fu可以分别诱导编辑前、后CNE2细胞表面MICA/MICB、ULBP2的表达,增强了CNE2细胞对Allo-NK细胞的激活和增加了CNE2细胞对Allo-NK细胞杀伤的敏感性。4通过干预抑制性和活化性信号系统,可以改变被编辑的Allo-NK细胞和CNE2细胞的生物学行为。本研究的创新点:首次发现Allo-NK细胞与CNE2细胞之间存在交互免疫编辑,编辑的分子基础是HLA-KIR和NKG2DL-NKG2D两个信号系统特异性配-受体分子改变,调节这两个信号系统相关分子能够提高Allo-NK细胞的活性和CNE2细胞对杀伤的敏感性。研究价值:本研究使我们从新的角度认识Allo-NK细胞与肿瘤细胞之间的相互关系,为建立遗传指导下个体化的过继性免疫化疗方案提供了理论和实验依据。