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猪源产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起初生和断奶仔猪腹泻的重要病原体之一,给养猪业造成巨大的经济损失,还降低了其生产效率。其中K88ac+ETEC是主要的致病菌,其引起的断奶仔猪腹泻（porcine post-weaning diarrhea,PWD）甚至导致仔猪发病死亡。其主要毒力因子包括黏附素和肠毒素。而细菌鞭毛作为一种新的毒力因子,在K88ac+ETEC致病机理中的作用仍不清楚。本论文中,我们以K88ac+ETEC国内参考株C83902（08:H19:K88ac+ LT+ STa+ STb+）为研究对象,围绕鞭毛与K88菌毛在细菌致病过程中的作用开展研究。此外通过全基因组测序,深入挖掘K88ac+ETEC中的新型毒力因子,并对其中的alpha菌毛进行鉴定。具体的研究内容如下:1.K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛的协同调控尽管细菌鞭毛已经被普遍认为是一种毒力因子,但是其在导致新生和断奶仔猪腹泻的K88ac+产肠毒素大肠杆菌致病机制中的作用不明晰。我们利用λ-Red同源重组技术构建了 C83902的ΔfliC,ΔfaeG,ΔmotA单基因缺失株以及ΔfliC ΔffaeG双基因缺失株,通过PCR及测序鉴定缺失株的正确。然后将表达FliC和FaeG的重组pBR322回补质粒分别导入缺失株构建回补株C83902ΔfliC/pfliC和C83902ΔfaeG/pfaeG。运动性试验、透射电镜以及玻板凝集试验用来确定缺失株和回补株的功能。细胞黏附试验结果显示,ΔfliC和AfaeG缺失株对于仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附能力分别下降20%和96%,ΔfliCΔfaeG双缺失株的黏附能力也下降97%,ΔmotA缺失株和回补株对IPEC-J2的黏附能力与野生株相似。qRT-PCR显示ΔfiC缺失株中faeG的转录水平较野生株显著下降21.5%,而AfaeG缺失株中fliC的表达水平是野生株的2.08倍;ΔmotA缺失株和回补株中fliC和faeG表达水平均恢复野生株水平。综合以上结果,我们证明了 K88+ETEC中鞭毛和K88菌毛协同调控表达。2.K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛对细菌生物被膜及群体感应的影响生物被膜保护下的细菌对各种抗生素具有高度耐性,并可逃避宿主免疫系统的清除作用。利用C83902野生株以及已经构建的ΔfliC、ΔfaeG缺失株,回补株,通过生物被膜测定试验比较发现,ΔffiC缺失株的生物被膜产生能力较野生株下降47.5%,而在ΔfaeG缺失株其生物被膜形成能力上升1.4倍。由于Ⅱ型群体感应是大肠杆菌重要的信号传导机制,且参与调控生物被膜的形成,我们检测了 AI-2分子活性并通过qRT-PCR验证AI-2相关基因的表达情况。相比野生株,ΔfliC缺失株、ΔfaeG缺失株和ΔfliCΔfaeG双缺失株AI-2分子活性分别下降16.2%、19.1%和21%。qRT-PCR结果显示ΔfliC缺失株中luxS和pfs的转录表达减少,而在ΔfaeG缺失株中其表达显著增加。本研究表明了鞭毛和K88菌毛在K88ac+ ETEC中,对生物被膜的形成和AI-2群体感应系统都是重要的影响因素。3.细胞脂筏在产肠毒素大肠杆菌鞭毛介导的肠上皮细胞促炎性反应中的作用探析脂筏是分布在细胞膜上富含胆固醇和鞘脂类物质有序排列的微区,参与很多重要的生物学过程。为探析脂筏是否介导ETEC鞭毛与肠上皮细胞膜相互作用,我们使用甲基-β-环糊精（MβCD）预先处理两种肠上皮细胞系（人结肠癌Caco-2细胞和仔猪空肠上皮IPEC-J2细胞）,去除其膜胆固醇,破坏脂筏结构,然后分别与重组大肠杆菌H1、H19鞭毛素孵育;回补组细胞添加外源性胆固醇孵育;对照组细胞全程仅使用培养基孵育。最后通过荧光定量和酶联免疫吸附试验的方法,确定对照组、处理组和回补组细胞中Toll样受体5（TLR5）相关促炎性因子的表达情况。结果显示,去除胆固醇后,通过鞭毛素激活的细胞内TLR5信号通路中白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在转录水平和蛋白表达水平上均较对照组未预先经MβCD处理的细胞下降约33%。而回补组中IL-8和TNF-α的表达水平与对照组无显著差异。本研究证明了脂筏中膜胆固醇介导宿主细胞对ETEC的TLR5途径先天免疫识别。4.全基因组测序K88ac+产肠毒素大肠杆菌C83902综合现有研究可知参与K88ac+ETEC致病过程中的毒力因子包括菌毛黏附素、鞭毛以及肠毒素等,为了挖掘新毒力因子并完善K88ac+ETEC的致病机制,本研究通过下一代测序技术对C83902进行全基因组测序,获得C83902的染色体基因组。该序列含有5,148个基因,总长度为4,920,255 bp,GC含量50.8%。CRISPRs分析显示C83902虽然携带CRISPR 1和CRISPR2,但在该菌进化中已丢失Cas酶相关基因。前噬菌体分析表明其染色体上含有5个完整的,1个不完整以及1个潜在的前噬菌体。大肠杆菌可以分为5个遗传谱系（plhylogroup）:A,Bl,B2,D和E。系统进化分析显示C83902属于遗传谱系A组,但与 B1 组的 0104:H42011C-3493,0103:H212009 以及人源 ETEC 菌株 E24377 的亲缘关系更接近。对C83902的毒力因子进行分类和比较后发现了 K88+ETEC上未见报道的alpha菌毛,stf菌毛,sfm菌毛以及longpolar菌毛等四种菌毛操纵子;此外,耶尔森菌强毒力岛和Ⅵ型分泌系统也作为新的ETEC毒力因子,值得深入研究。5.K88ac+产肠毒素大肠杆菌alpha菌毛的克隆、表达和鉴定针对全基因组测序发现的多个新型毒力因子,我们选择了 alpha菌毛并对其开展了初步的鉴定工作。根据全基因组测序数据分析获得alpha菌毛操纵子由四个基因组成。通过BLAST软件与GenBank上不同大肠杆菌全基因组序列比对,发现该操纵子主要分布于ETEC,APEC,UPEC等致病菌株。设计引物扩增操纵子并克隆到pET42a（+）中,IPTG诱导该菌毛在大肠杆菌C3040上表达,透射电镜观察菌毛形态。通过细胞黏附试验,发现alpha菌毛对人结肠癌细胞Caco-2无显著体外黏附作用。本研究首次对ETEC alpha菌毛进行了鉴定,为K88ac+产肠毒素大肠杆菌中新毒力因子的发掘和致病机制的阐释提供理论基础。