感官驱动假说认为,动物的通讯信号和信号接收系统会随着当地气候条件的变化而变化,以适应当地环境。不同的环境条件可能会导致不同种群之间的表型、基因型和基因表达的多样性,最终导致生殖隔离,这是生态物种形成的基础。蝙蝠作为世界上最为独特的生物类群之一,不但在生态系统中起到重要作用,而且其独特的回声定位系统在各个方面启发了科技的发展。近年来,越来越多的研究开始关注蝙蝠回声定位声波频率的地理变异,并证明了蝙蝠回声定位信号的感官驱动,加深了对物种形成机制的理解。然而,这些研究大部分集中于生态学层面,我们对蝙蝠声音信号地理变化背后的分子机制了解甚少。随着测序技术的发展,出现了新兴的交叉学科——生态基因组学,生态基因组学旨在结合多种学科和研究手段,解释表型、基因和环境之间的关系。马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)使用恒频(CF)声波,具有高度发达的声纳系统,发声行为多样,一直以来都是蝙蝠回声定位声波、生态学、行为学和神经生理学研究的理想物种。其在中国分布广泛,在遗传水平上可以分为三个谱系:东北(NE)、中东(ME)和西南(SW),这三个谱系的回声定位声波具有明显的地理差异,而这种变异被认为和环境条件有关。因此马铁菊头蝠是研究回声定位声波地理变异分子机制的良好模型。在本研究中,我们以中国马铁菊头蝠作为研究对象,使用多种数据和分析手段,结合遗传、表型以及环境之间的关系探究回声定位声波地理变异的分子机制。考虑到耳蜗在回声定位过程中的重要作用,我们通过获取马铁菊头蝠三个谱系的三个代表性种群的高质量耳蜗转录组数据,获取有关基因表达、序列变异和直系同源基因的精确信息,通过不同种群的差异表达分析、加权共表达网络分析(WGCNA)、选择压力分析和离群位点检测等手段,明确基因表达和序列分化对表型造成的影响。此外,我们还获取了11个种群共87个个体的简化基因组(GBS)的基因分型测序数据,结合环境数据和多种离群值检验方法,获取了蝙蝠声学变异的候选基因并研究这些基因对表型的影响。首先对中国马铁菊头蝠的三个代表性种群14个个体的耳蜗的组织进行RNA–seq并比较了种群之间基因的表达差异。使用qPCR验证RNA–seq的基因表达结果。共获取8,190个差异表达基因(DEGs),通过WGCNA分析,发现一些DEGs模块与蝙蝠静息频率(RF)或前臂长(FL)显著相关,这些模块内的基因显著富集于多种与神经和肌肉功能相关的通路,例如突触功能、神经元功能、离子通道功能、对声音的响应、学习行为、肌肉和肌动蛋白的功能等。这些结果表明神经的活性、发声学习过程和肌肉代谢与马铁菊头蝠回声定位声波的特性有关。尽管无法确定具体的基因,但是我们的结果仍然表明这些基因具有潜在的重要性。使用RNA–seq数据执行的比较转录组分析结果表明三个种群受到不同的选择压力。在三个种群分支上检测到的受正选择基因涉及多种功能,例如纤毛形成、氧化还原酶活性和免疫等过程。但是这些受到正选择的基因与听觉没有直接关系。RNA–seq数据中的SNP位点为理解声音信号的地理变异提供了另一种思路,结合离群值检测方法和基因环境关联分析(GEA)方法,我们发现349个候选位点,涉及到多种生物功能,包括免疫过程、转录过程和突触过程,其中18个与听觉相关的过程或听觉器官的发育有关。结合基因表达数据,我们发现在这些基因中的五个(ERBB4、OTOGL、IL6R、CKMT2和LGR6),在三个种群间显著差异表达,而ERBB4在与RF显著相关的DEGs模块中。暗示了这些基因在回声定位声波地理变异中的重要作用。对马铁菊头蝠11个种群87个个体进行GBS测序,预测SNP并过滤。种群结构分析结果表明SW谱系出现内部分化,而且出现不同谱系个体的混聚现象,暗示了谱系间基因流的存在。我们发现回声定位声波RF的地理变异和环境因子(尤其是温度)密切相关。利用环境数据并结合四种离群值检测方法,我们获取了210个至少被两种方法预测的候选位点,在具备有效注释的26个候选位点中,GNAI、TMPRSS、SPIN1、Wnt9b和UNKL与听觉直接相关,涉及到耳蜗发育、毛细胞发育等功能。其中TMPRSS、Wnt9b和UNKL参与Wnt信号通路,它们的功能与激活、调控或是调控Wnt下游通路有关,该通路涉及到耳蜗毛细胞的平面极化,使耳蜗的不同位置对不同的频率产生反应。这表明Wnt通路可能在蝙蝠主频地理变异中的起重要作用。我们的研究发现了大量候选基因和通路,尽管基因表达的变化以及这些基因中特定氨基酸取代的功能尚不清楚,但分析结果表明这些基因在回声定位声波地理变异中的重要性。在这项研究中,即使回声定位声波主频的变异可以部分解释基因表达和序列变异的变化,未来的功能验证实验也是必不可少的。此外,我们的结果暗示Wnt通路以及其他与耳蜗发育有关位点的重要性,因此研究谱系之间耳蜗结构是否发生变化也将帮助我们理解回声定位声波的地理变异。综上所述,本研究整合多种方法,结合基因、表型和环境数据阐明可能与马铁菊头蝠回声定位声波地理变异密切相关的差异表达基因或序列变异,有助于解释马铁菊头蝠声音信号地理变异的遗传基础,进而为理解蝙蝠声信号感官驱动的分子机制、生态物种形成,以及保护生物学提供更多证据。