骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变为主要特征的慢性关节退行性疾病,常引起关节疼痛甚至残疾,严重影响患者生活质量,以及给社会和家庭带来巨大经济负担。在OA病因学研究中,OA与代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的联系愈来愈受到人们重视。越来越多的学者认为,OA属于MS范畴。英国学者Barker基于大规模流行病学调查结果发现,宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)患儿成年后MS的发病率增加,并提出“成人疾病发育起源”假说。尽管OA与MS、MS与IUGR之间的相关性研究报道日益剧增,但至今OA与IUGR间直接联系的研究较少。一项流行病学研究表明,男性低出生体重者发生手部OA的比例明显较高于对照组,女性也有类似的趋势。提示,OA与MS一样存在胎儿起源。关节软骨是OA病理改变的主要组织,其质量和OA的发病密切相关。有研究提示,关节软骨的质量高低与OA发生具有相关性。关节软骨组织主要形成于胚胎时期,宫内关节软骨发育异常可能是成年OA易感的重要原因之一。有研究表明,软骨胆固醇代谢异常,其所致的软骨胆固醇蓄积与成年OA的发生关系密切。提示,胎源性OA的发生机制还,包括关节软骨的胆固醇蓄积。已知正常软骨细胞主要通过分泌蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)组成细胞外基质,以维持关节软骨的生理功能。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)信号通路在软骨细胞的发育分化过程中起到重要作用。TGFβ-Smad2/3是启动软骨基质合成基因转录的关键通路,对于关节软骨发育具有重要意义。研究发现,软骨胆固醇流出通路障碍也参与介导了成人OA软骨胆固醇蓄积的发生。而TGFβ信号通路也可促进胆固醇流出相关基因的表达。流行病学调查显示,尼古丁的摄入不利于个体本身的软骨健康,吸烟的骨关节炎患者,其软骨丢失和疼痛的风险要远高于不吸烟的患者。动物实验也表明,对于预先暴露于尼古丁刺激的大鼠,关节炎发病时炎症反应更为明显,关节损伤也更为严重。一项流行病学研究提示,母亲孕期吸烟可显著增加子代肌肉骨骼系统异常发育的风险,并且表明,孕期尼古丁暴露(prenatal nicotine exposure,PNE)是导致IUGR的确切和危险诱因之一。本实验室前期系列研究证实,PNE能削弱胎盘糖皮质激素(glucocorticoids,GC)屏障作用,并并且引起胎儿“母源性高GC”,使IUGR胎儿成年后MS易感性增加,存在“神经内分泌代谢编程机制”;本实验室还发现,PNE可致胎鼠生长板软骨发育迟缓,其机制可能与母源性高GC有关。大量研究已证实,孕期不良环境下出现的母源性高GC与子代宫内编程改变之间存在密切关系。有研究还发现,孕期高GC可抑制胎儿骨骼的纵向生长母源性高GC可导致软骨细胞增殖下降、基质合成减少、关节软骨变薄并导致软骨外基质含量下降,其机制可能为过高的GC抑制了胎鼠软骨细胞增殖和其TGFβ信号通路;并并且细胞实验证实,过高的GC水平可抑制细胞TGFβR的表达。鉴于上述,那么PNE是否可通过“母源性高GC”导致子代出生后的OA易感性增加?其发生机制可能与软骨TGFβ信号通路以及胆固醇流出通路编程改变有关?PNE子代成年后的胆固醇流出通路低编程改变是否加重了 OA易感性增加?这些问题均未见到相关研究文献。为此,本课题拟进行如下工作:利用PNE所致子代IUGR模型和关节腔内木瓜蛋白酶注射OA模型,证实PNE所致子代软骨胆固醇蓄积和OA易感现象;进一步观察PNE子代软骨TGFβ信号通路和胆固醇流出通路在宫内的变化,探讨PNE子代OA易感的宫内编程机制;通过给予子代出生后降脂药普伐他汀,通过反证探PNE子代OA易感的胆固醇蓄积机制。本课题的实施有助于我们更全面的认识PNE子代OA易感现象及其宫内编程机制,更好的理解胎源性OA,也对进一步探索OA的早期预防和治疗具有指导意义。第一部分孕期尼古丁暴露可致子代雄性大鼠关节软骨胆固醇蓄积及骨关节炎易感目的:本部分研究拟利用PNE所致子代IUGR大鼠模型和膝关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导OA模型,观察PNE是否可引起IUGR子代成年后软骨发育不良,及软骨胆固醇蓄积和OA易感性增加。方法:宫内:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和尼古丁组。自GD9起至GD20,尼古丁组分别皮下注射给予尼古丁 2mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。出生后:PNE组随机留取部分孕鼠让其自然生产,仔鼠生后12周(postnatal week,PW12),乙醚麻醉处死,取膝关节组织。OA造模:PNE雄性仔鼠(2mg/kg.d)及对照组雄性仔鼠自断奶后,给予正常饮食至8周龄,于PW8时行膝关节腔内注射木瓜蛋白酶造OA模型[80],对照组和PNE组大鼠分别于造模开始的第1、4、7、10和13日经左膝关节腔内内注射4%木瓜蛋白酶溶液100μl;大鼠右膝于上述时间点注射等量生理盐水。在PW12,经乙醚麻醉处死大鼠,取下肢膝关节。结果:①与对照组相比,PNE组大鼠成年后未接受木瓜蛋白酶刺激时,其关节软骨大体形态较对照组改变较少;给予木瓜蛋白酶刺激后,PNE组关节软骨行墨汁染色出现肉眼可见,软骨表面严重磨损,关节软骨表面失去光泽并毛糙;②给予木瓜蛋白酶刺激后,行番红O-固绿染色发现,与对照组相比,PNE组出现明显的软骨表面磨损,软骨基质结构紊乱,软骨厚度变薄,基质染色变浅,软骨细胞数明显减少和潮线模糊,并且PNE组改良Mankin’s评分较对照组升高更显著(P<0.01);③并并且PNE组软骨Col2a1和Aggrecan的mRNA表达显著降低(P<0.01);④与对照组相比,PNE组子代软骨出生后胆固醇流出通路表达明显降低;胆固醇蓄积指标,以及软骨炎症,凋亡指标,明显升高(P<0.05)。结论:PNE可致子代关节软骨发育不良,并且软骨出现胆固醇蓄积,在给予膝关节腔内注射木瓜蛋白酶刺激后,更易导致OA的发生。第二部分孕期尼古丁暴露致子代雄性大鼠骨关节炎易感的宫内编程机制目的:本部分拟通过整体动物实验,观察PNE子代胎鼠在宫内时期软骨TGFβ信号通路和胆固醇流出通路表达,以探讨PNE所致子代大鼠成年软骨胆固醇蓄积和OA易感的宫内编程机制。方法:宫内:Wistar母鼠自然受孕后。自GD9起至GD20,皮下注射给予尼古丁 2mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。在GD20时,采用乙醚麻醉孕鼠,剖腹取出胎鼠留取每窝胎仔数为8-14只的母鼠及其胎鼠。记录胎鼠的体重和性别,取雄性胎鼠膝关节组织。结果:①与对照组相比,PNE组关节软骨Col2a1、Aggrecan的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01);②软骨TGFβ信号通路表达:与对照组相比,PNE组子代在宫内关节软骨TGFβRI、Smad2、Sox9的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01);③软骨胆固醇流出通路表达:PNE组子代在宫内关节软骨LXRa的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01),并且SR-B1和ABCA1的mRNA和蛋白也有明显降低(P<0.01)。结论:我们发现,在宫内PNE可能通过母源性GC导致子代软骨TGFβ信号通路和胆固醇流出通路的低功能编程,进而导致子代软骨发育不良以及胆固醇蓄积。第三部分普伐他丁可改善孕期尼古丁暴露所致子代雄性大鼠关节软骨胆固醇蓄积及骨关节炎易感目的:本部分拟通过整体动物实验给予降脂药普伐他汀,观察子代大鼠软骨质量以及胆固醇流出通路及OA的表现,并探讨其可能的原因和机制。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PNE组。自GD9起至GD20,分别皮下注射给予尼古丁 2 mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。待孕鼠自然生产后,PNE雄性仔鼠给予正常饮食至8周龄,于PW8时行普伐他汀(20mg/kg.d)或等体积生理盐水皮下注射处理至PW12,期间分组予以关节腔内注射木瓜蛋白酶OA造模。即随机将对照组和PNE组大鼠分为对照+生理盐水组、对照+普伐他汀组、PNE+生理盐水组和PNE+普伐他汀组。在PW12,经乙醚麻醉处死大鼠,取双侧下肢膝关节,待行后续指标检测。结果:①给予木瓜蛋白酶刺激后,与PNE+生理盐水组相比,PNE+普伐他汀组关节软骨行墨汁染色出现肉眼可见的软骨表面尤其是胫骨平台软骨表面磨损明显减轻;②在生理盐水组,PNE组软骨胆固醇流出通路LXRa、SR-B1、ABCA1的mRNA表达较对照组均显著降低(P<0.01),并且PNE组软骨Col2a1和Aggrecan的mRNA表达也较对照组显著降低(P<0.01);而在普伐他汀组,PNE组软骨胆固醇流出通路LXRa、ABCA1和SR-B1显著降低(P<0.01),而PNE组软骨Col2a1和Aggrecan也显著降低(P<0.01);③在PW12时,与PNE+生理盐水组相比,PNE+普伐他汀组软骨炎症及基质降解指标IL-1、IL-6、MMP-3和MMP-13表达显著降低(P<0.01);并且软骨胆固醇蓄积指标LDL、oxLDL、LOX-1表达也显著降低(P<0.01)。结论:他汀类药物可改善PNE所致的成年子代大鼠软骨胆固醇流出通路抑制,从而减轻软骨胆固醇蓄积,减轻OA易感。