【摘 要】
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肺是失血性休克后最早、最易受累的器官之一,失血性休克导致急性肺损伤（ALI）的发生率高达80%,且ALI发展为急性呼吸窘迫综合征后的病死率约为40%。因此,探索ALI的发生机制并以此决策ALI的干预措施对于防治重症失血性休克极为重要。研究表明,核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化介导的炎症反应失控是重症失血性休克引起ALI的重要机制之一;瞬时感受器电位M2型（TRPM2）通道活化
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肺是失血性休克后最早、最易受累的器官之一,失血性休克导致急性肺损伤（ALI）的发生率高达80%,且ALI发展为急性呼吸窘迫综合征后的病死率约为40%。因此,探索ALI的发生机制并以此决策ALI的干预措施对于防治重症失血性休克极为重要。研究表明,核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化介导的炎症反应失控是重症失血性休克引起ALI的重要机制之一;瞬时感受器电位M2型（TRPM2）通道活化介导Ca2+内流参与诸多信号通路的调节过程,且活性氧（ROS）依赖的TRPM2通道活化参与了多种因素诱导的NLRP3炎症小体活化、炎性细胞因子分泌及炎症反应的发生、发展。但TRPM2通道及其介导NLRP3炎症小体活化在失血性休克ALI发生中的作用,尚不清楚。为此,本研究应用TRPM2-/-、NLRP3-/-小鼠,观察了失血性休克后小鼠肺组织结构、含水量、炎性因子、相关蛋白表达等指标的变化,以明确TRPM2通道与NLRP3炎症小体及其交互作用在失血性休克ALI发生机制中的作用。首先,进行野生型（WT）、NLRP3-/-与TRPM2-/-小鼠基因型的验证。结果显示,WT小鼠有NLRP3、TRPM2基因的特异性扩增条带,NLRP3-/-小鼠无NLRP3基因的特异性扩增条带,TRPM2-/-小鼠无TRPM2基因的特异性扩增条带;NLRP3-/-小鼠无NLRP3蛋白表达,TRPM2-/-小鼠无TRPM2蛋白表达。随后,应用WT、NLRP3-/-与TRPM2-/-小鼠常规方法建立失血性休克模型（40 mm Hg,90 min,放出全血与等量林格氏液进行液体复苏）,观察不同组小鼠存活时间的变化。然后,应用WT、NLRP3-/-与TRPM2-/-小鼠随机分为:假手术组（Sham）、休克组（Shock）,急性失血、液体复苏结束后3 h或相应时间点,留取肺组织,观察肺组织形态,检测肺组织含水量,检测髓过氧化物酶（MPO）表达以及ROS、IL-1β、IL-18水平;Western Blot方法检测WT小鼠TRPM2、NLRP3表达,检测TRPM2-/-小鼠NLRP3表达,检测NLRP3-/-小鼠TRPM2表达。结果显示,NLRP3-/-与TRPM2-/-小鼠失血性休克后的存活时间均显著高于WT小鼠。组织形态学观察显示,假手术小鼠肺组织结构基本正常,休克小鼠肺组织出现了肺小叶间隔增厚、炎性浸润增加,肺泡壁有水肿,可见肺泡充血、出血等,且肺组织含水量增加;与WT小鼠比较,TRPM2-/-与NLRP3-/-休克小鼠肺组织损伤程度较轻,肺组织含水量降低,表明敲除TRPM2与NLRP3基因减轻了失血性休克ALI。WT休克小鼠肺组织MPO、NLRP3、TRPM2表达以及ROS、IL-1β、IL-18水平均明显高于假手术小组;TRPM2-/-与NLRP3-/-休克小鼠肺组织MPO表达以及ROS、IL-1β、IL-18水平均显著低于WT休克小鼠,且NLRP3-/-休克小鼠肺组织MPO表达低于TRPM2-/-休克小鼠;TRPM2-/-小鼠肺组织NLRP3表达显著低于WT休克小鼠,NLRP3-/-休克小鼠肺组织TRPM2表达显著低于WT休克小鼠。最后,为了深入揭示TRPM2通道与NLRP3炎症小体相互作用的分子机制,本文从蛋白互作、mi RNA与基因调控、转录因子（TF）与基因调控等角度出发,采用生物信息学研究手段,筛选了以TRPM2和NLRP3为中心节点的互作蛋白、共同的mi RNAs以及TFs,分析了TRPM2与NLRP3基因、SMAD3与mi RNA三者之间的关系,确定了87个相关的mi RNAs。综上所述,TRPM2通道与NLRP3炎症小体及其交互作用可能参与了失血性休克肺损伤的发生。生信分析提示TRPM2通道与NLRP3炎症小体的互作可能与相关的转录因子、mi RNA有关,为后续研究提供了基础。
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