变形链球菌(Streptococcus mutans,S.m)被公认为重要的致龋菌,其主要的毒力因子包括产酸耐酸性,黏附素、葡聚糖的产生,其发挥致龋作用的重要前提条件是形成菌斑生物膜结构。密度感应是细菌之间进行信号传递的一种特殊机制,其本质是细菌对外界的信号进行识别并转变为基因激活或其他细胞反应。密度感应信号系统在变形链球菌生物膜形成、感受态形成、毒力因子表达等方面起着重要的作用。变形链球菌是革兰阳性菌,拥有Lux-S及AI-2介导的密度感应系统,控制不同种属间的信号交流;及一个肽信号介导的双组份密度感应系统,对细菌种属内信号交流进行调控。变形链球菌com感受态基因家族属于双组分信号系统,comD基因编码的是一个二聚体化跨膜感受器,它能感受特异性的刺激,将外界信号传递到胞内。已有研究证明comD基因与细菌的基因转化、对酸的耐受性和感应性、细菌素的产生及生物膜的形成有关,但目前关于该基因与变形链球菌致主要龋毒力因子的相关性研究尚未深入。目的本实验拟通过构建S.mUA159 comD基因缺陷菌株,进一步探讨comD基因对S.mUA159致龋毒力的影响,从基因水平探讨S.m密度感应信号系统与其致龋毒力的相关性,为研究密度感应信号系统调控在龋病防治中的意义提供一定的理论依据。方法1应用长臂同源多聚酶链式反应法(LFH-PCR)制备中间为红霉素耐药基因(erm),两侧为comD基因上、下游同源序列的连接片段,并将此片段转化入S.mUA159标准菌株,在含红霉素的BHI琼脂平板上筛选出转化菌株,并对转化菌株进行形态学鉴定、生化特性检测、PCR、RT-PCR及测序鉴定。2比较S.mUA159comD缺陷菌与标准菌致龋相关毒力的差异。2.1扫描电镜观察分析S.mUA159 comD缺陷菌与标准菌在人牙釉质表面形成的菌斑生物膜结构:在含2%蔗糖的BHI培养条件下,扫描电镜观察比较6h、12h、24h三个时间点上comD缺陷菌与标准菌生物膜的形成情况2.2应用荧光定量PCR(FQ-PCR)法定量检测S.mUA159 comD缺陷菌与标准菌中多糖代谢相关基因(gtfB、gtfD、gtfC、ftf)mRNA的表达水平2.3检测S.mUA159 comD缺陷菌与标准菌中与产酸相关的乳酸脱氢酶(LDH)酶活性水平结果1形态学观察及生化检测发现转化菌株为变形链球菌,RT-PCR、PCR及序列测序结果显示comD基因完全被erm基因所替代,表明S.m UA159 comD缺陷菌株构建成功。2对comD缺陷菌株和标准菌株在三个时间点形成的生物膜的结构观察发现,两个菌株在6h、12h、24h时均有明显的生物膜形成,comD缺陷菌株形成的生物膜孔隙较大、结构较疏松。3 FQ-PCR分析结果显示:在comD缺陷菌株中4个与多糖代谢相关的基因(gtfB、gtfC、gtfD、ftf )mRNA表达水平均下调,与标准菌株相比差异具有统计学意义(P<0.001)。4对S.m标准菌与缺陷菌LDH的测定结果显示:在缺陷菌株中,LDH酶活性水平降低,与标准菌株之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1用LFH-PCR技术制备基因突变体,可完全替代靶基因,是S.m功能基因组研究的一种有效的方法。2 S.m UA159 comD基因缺陷后,与多糖代谢酶相关的gtfB、gtfD、gtfC、ftf基因mRNA表达水平下调,与产酸性密切相关的LDH酶活性也降低,形成的菌斑生物膜也有结构上的缺陷,因此本课题研究结果表明comD基因对S.m UA159致龋相关的重要毒力因子具有调控作用。