目的:天然酚类物质具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多种药理活性,是一类极具药物开发潜力的化合物。然而,该类化合物体内显效形式和机制尚不明确。因此,阐明其体内代谢及处置过程极为重要。本论文将评价葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)在天然酚类化合物体内处置中的作用,阐明代谢调控的作用机制,为明确该类物质体内药效物质基础提供科学依据。具体研究目标如下:(1)测定两种酚类化合物(辣椒素和补骨脂定)的UGT代谢活性;(2)评价外排转运体【如乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和多药耐药相关蛋白(MRPs)】在UGT代谢物胞外转运中的作用;(3)考察外排转运体对UGT代谢的调控效应;(4)阐明外排转运体调控UGT代谢的作用机制。方法:1.采用酶孵育法,分别测定辣椒素和补骨脂定在微粒体以及各UGT亚型酶中的代谢活性。并通过相关性分析及活性相关因子法(RAF),确定代谢辣椒素和补骨脂定的主要UGT亚型酶。2.采用慢病毒转染技术,构建UGT1A1酶高表达的He La细胞株(简称为He La1A1细胞)。使用化学抑制法(即BCRP抑制剂Ko143、MRPs抑制剂MK-571)及生物抑制法(sh RNA介导的基因沉默),考察外排转运体在UGT代谢物外排中的作用。3.采用慢病毒转染sh RNA技术,构建单一外排转运体(BCRP、MRP1、MRP3和MRP4)低表达的He La1A1细胞株(简称为He La1A1-BCRP-sh RNA、He La1A1-MRP1-sh RNA、He La1A1-MRP3-sh RNA和He La1A1-MRP4-sh RNA)。测定三种酚类化合物(染料木素、芹菜素和大黄素)在上述细胞株中的总代谢程度——fmet,考察外排转运体对UGT代谢的调控效应。4.基于He La1A1和He La1A1-MRP4-sh RNA细胞模型,以染料木素和芹菜素为模型化合物,测定不同时间点的代谢物外排速率及胞内蓄积。构建二室药代动力学模型,模型中引入UGT代谢、转运以及去葡萄糖醛酸化反应等过程。将此模型与药动学实验数据进行拟合,评价去葡萄糖醛酸化反应(即无效循环)在外排调控UGT代谢中的作用。结果:1.辣椒素和补骨脂定易被UGT酶代谢(a)辣椒素在人肝微粒体(HLM)中发生UGT代谢,代谢辣椒素的亚型有UGT1A1、1A3、1A7、1A8、1A9、2B7、2B15和2B17。辣椒素代谢速率与UGT1A1蛋白水平以及β-雌二醇(UGT1A1特异性底物)代谢速率呈显著性相关(P<0.05)。同时,辣椒素代谢速率与UGT2B7蛋白水平以及齐多夫定(UGT2B7特异性底物)代谢速率也具有显著相关性(P<0.01)。此外,UGT1A1和2B7对辣椒素代谢的贡献率分别为30.3%和49.0%。上述结果表明,UGT1A1和2B7是代谢辣椒素的主要亚型酶。(b)补骨脂定在HLM中发生UGT代谢,产生两个代谢物(即9-O-G和3-O-G)。参与补骨脂定代谢的亚型酶有UGT1A1、1A7、1A8和1A9。其中,仅UGT1A9介导3-O-G的产生,提示UGT1A9特异性催化补骨脂定(3-OH)的代谢,3-O-G可能为UGT1A9活性的标记物。抑制HLM中UGT1A9的活性,能显著抑制补骨脂定(3-OH)的代谢。补骨脂定(3-OH)代谢速率与UGT1A9蛋白水平及丙泊酚(UGT1A9特异性底物)代谢速率具有显著相关性(p<0.001)。此外,UGT1A9在补骨脂定(3-OH)代谢中的贡献率为99.6%。以上结果表明,补骨脂定(3-OH的代谢)可以作为UGT1A9的标记性底物。2.外排转运体BCRP和MRPs在UGT代谢物外排中起重要作用成功构建了He La1A1细胞株。白杨素在该细胞株中能发生UGT代谢。抑制BCRP和MRPs的活性,能显著降低代谢物外排速率和清除率(p<0.01)。降低单一外排转运体(BCRP、MRP1、MRP3和MRP4)的表达量,同样导致代谢物外排速率和清除率显著降低(p<0.01)。说明,BCRP、MRP1、MRP3和MRP4介导UGT代谢物的外排。3.外排转运体对UGT代谢具有调控效应成功构建了单一转运体低表达的He La1A1-BCRP-sh RNA、He La1A1-MRP1-sh RNA、He La1A1-MRP3-sh RNA和He La1A1-MRP4-sh RNA细胞株。对比He La1A1细胞,染料木素、芹菜素和大黄素在上述细胞株中的代谢程度以及代谢物外排速率均显著下降(p<0.01)。此结果提示,外排转运体是影响UGT代谢的关键因素,BCRP、MRP1、MRP3和MRP4可以调控细胞内的UGT代谢。4.无效循环可能为外排转运体调控UGT代谢的主要作用机制与He La1A1细胞相比,染料木素和芹菜素在He La1A1-MRP4-sh RNA细胞中的总代谢程度和代谢物外排速率均显著降低(P<0.01)。当引入无效循环过程时,模型与药动学实验数据拟合度高。拟合结果提示,无效循环为外排转运体调控UGT代谢的作用机制。结论:1.辣椒素和补骨脂定易被UGT酶代谢。主要负责辣椒素代谢的亚型酶为UGT1A1、和2B7,主要负责补骨脂定代谢的亚型酶为UGT1A1、1A7、1A8和1A9。此外发现,补骨脂定(3-OH的代谢)可以作为UGT1A9的特异性底物。2.外排转运体BCRP、MRP1、MRP3和MRP4介导UGT代谢物的外排,并能调控UGT代谢。无效循环可能是外排转运体调控UGT代谢的主要作用机制。