研究背景与目的:肝癌是世界范围内第五大最常见的恶性肿瘤,尽管近年来肝癌的临床诊断及治疗都有了很大的进步,但其复发率仍然很高,存活率也较低,并且肝癌对大多数抗癌药物具有较低的敏感性,因此,迫切需要找到能够增加化疗敏感性的方法。此外,胰岛素抵抗可以促进肝癌的发生发展,是肝癌发病的风险因素之一。罗格列酮(Rosiglitazone,ROSI)是噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,临床中主要用于治疗胰岛素抵抗的2型糖尿病。最近的研究表明,ROSI对人类恶性肿瘤细胞具有一定的抗癌活性,与某些化疗药合用可减少化疗药物的副作用。在本论文中,我们首先从细胞水平研究了胰岛素抵抗的肝癌HepG2/IR细胞耐药的具体机制,然后从细胞和动物两个方面研究了罗格列酮与化疗药物合用对胰岛素抵抗肝癌细胞的增殖、自噬、凋亡、周期、迁移以及肿瘤组织生长的影响,初步探究了两种药物合用协同抗胰岛素抵抗肿瘤作用的分子机制。实验方法:1.胰岛素抵抗细胞模型的建立采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法和Western blotting实验分别检测胰岛素诱导48小时后,肝癌HepG2细胞的葡萄糖消耗量和细胞表面胰岛素受体表达的变化,以确定胰岛素诱导胰岛素抵抗肝癌HepG2细胞模型的最佳浓度。通过检测HepG2细胞的甘油三酯(TG)水平,来进一步确定胰岛素抵抗HepG2细胞(HepG2/IR)模型是否成功建立。2.检测ROSI和化疗药物对HepG2和HepG2/IR细胞的毒性作用采用MTT法测定ROSI和顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5FU)、索拉非尼(SOR)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(TAX)单用或合用对肝癌HepG2细胞和HepG2/IR细胞的增殖抑制作用,测定化疗药物的IC50确定HepG2/IR细胞对化疗药物的耐药倍数以及ROSI与化疗药合用产生协同抑制作用的最佳药物浓度。同时,检测了ROSI和ADM合用浓度下对人正常细胞HUVEC和HL-7702的细胞毒性作用。3.检测ROSI和ADM合用的抗肿瘤作用是否依赖于PPARγ通路加入PPARγ拮抗剂GW9662,利用MTT法检测GW9662是否会影响ROSI与ADM的协同抗肿瘤作用。4.检测HepG2和HepG2/IR细胞的P-gp功能和蛋白表达水平采用罗丹明123胞内蓄积实验和Western blotting方法分别检测HepG2细胞和HepG2/IR细胞的P-gp外排功能和P-gp蛋白表达。5.检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞自噬的影响采用吖啶橙染色法检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞酸性自噬泡的影响。通过Western blotting法检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞自噬相关蛋白MAPILC3B2和EGFR/ERK信号通路蛋白分子表达的影响。6.检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞凋亡的影响ROSI和ADM合用于HepG2/IR细胞48小时后,通过Hoechst 33342染色法观察各组细胞的细胞核形态,通过细胞核的染色情况判定发生凋亡的细胞数量。采用Annexin V-FITC/PI双染法(流式细胞仪)来定量检测ROSI和ADM合用诱导HepG2/IR细胞的凋亡率。同时,采用Western blotting方法检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。7.检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞周期分布的影响通过PI单染色法(流式细胞术)检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞周期分布的影响。8.检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞迁移能力的影响采用划痕实验检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞的迁移率的影响,采用Western blotting实验测定ROSI和ADM合用对基质金属蛋白酶MMP-2表达量的影响。9.ROSI和ADM合用对HUVEC血管生成的影响采用划痕实验和小管形成实验检测ROSI和ADM合用对HUVEC迁移和管状结构形成的影响。10.检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞内Akt/mTOR信号通路的影响采用Western blotting实验检测ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞内Akt/mTOR信号通路的蛋白分子表达的影响。11.胰岛素抵抗动物模型的建立采用DXMS法和STZ法诱导胰岛素抵抗小鼠模型,通过检测昆明小鼠的体重、空腹血糖水平(FBG)、空腹胰岛素水平(FINS)、口服糖耐量(Oral glucose tolerance,OGTT)、胰岛素抵抗指数(HOMO-IR)来确定胰岛素抵抗动物模型的最佳诱导条件。12.检测ROSI和ADM合用对胰岛素抵抗昆明小鼠体内H22移植瘤的生长抑制作用建立H22细胞的小鼠移植瘤模型,连续给药6天[ROSI组(灌胃,4mg/kg)、ADM组(腹腔注射,2mg/kg)],观察ROSI和ADM合用对移植瘤生长的影响;同时检测ROSI能否提高ADM的抗肿瘤疗效以及对小鼠体重、肝脏指数和心脏指数的影响以确定ROSI能否降低ADM导致的肝脏毒性和心脏毒性。实验结果:1.胰岛素诱导胰岛素抵抗HepG2/IR细胞模型的建立0、0.1、0.5、1μmol/L胰岛素诱导HepG2细胞48小时后,使HepG2细胞的葡萄糖消耗量分别下降了 10.2%、22.8%、47.7%。Western blotting实验结果显示,1μmol/L胰岛素显著抑制HepG2细胞胰岛素受体(IR)表达。此外,1μmol/L胰岛素诱导48小时显著抑制HepG2细胞甘油三酯(TG)水平。结果提示,1μmol/L胰岛素诱导HepG2细胞48小时成功建立胰岛素抵抗HepG2/IR细胞模型。2.ROSI和化疗药物合用产生协同抗HepG2/IR细胞体外增殖的作用与HepG2细胞相比,ADM、5FU、SOR、VCR、TAX单用于HepG2/IR细胞时,IC50均显著上升。HepG2/IR细胞对ADM的耐药倍数最大,达到7.03倍。不同浓度的ROSI与ADM合用时,均能协同增强ADM对HepG2/IR细胞的生长抑制作用,其中1Oμmol/LROSI与ADM合用,逆转耐药倍数最大,可使ADM对HepG2/IR细胞的IC50(μmol/L)由2.43±0.39下降到0.95±0.08。二者合用对正常细胞的MTT实验结果显示,在上述协同作用最明显的浓度下两药合用对人正常细胞HUVEC和HL-7702均未呈现明显的毒性和增殖抑制作用,说明ROSI与ADM能够选择性的杀伤肿瘤细胞。3.ROSI对ADM细胞毒性的协同作用不依赖于PPARγ通路MTT实验结果显示,PPARγ拮抗剂GW9662不影响ROSI与ADM的协同抗肿瘤作用。4.HepG2/IR细胞P-gp功能和表达未发生明显变化罗丹明123胞内蓄积实验和Western blotting实验结果显示,与HepG2细胞相比,HepG2/IR细胞P-gp功能和表达未见明显变化。5.ROSI与ADM合用抑制HepG2/IR细胞自噬水平吖啶橙染色实验结果显示,HepG2/IR细胞自噬水平显著上升,ROSI与ADM合用后HepG2/IR细胞酸性自噬泡数量明显减少。Western blotting实验结果显示,ROSI与ADM合用显著抑制HepG2/IR细胞内自噬相关蛋白MAP1LC3B2和EGFR/ERK信号通路蛋白分子的表达,与HepG2/IR细胞空白对照组相比有显著性差异。6.ROSI与ADM合用促进HepG2/IR细胞凋亡Hoechst染色实验结果显示,HepG2/IR细胞空白对照组细胞核呈饱满椭圆形,染色质均匀着色,而ADM加药组Hochest染色观察到不规则的细胞核形态,可见凋亡小体,出现明显的细胞凋亡形态,ROSI与ADM合用组的凋亡细胞数量明显高于ADM单用组。Annexin V-FITC/PI双染法实验结果显示,ROSI与ADM合用引起的细胞凋亡率明显高于ADM单药组和空白对照组,从ADM单药组的14.69%提高到两药合用组的23.51%。Western blotting实验结果显示,ROSI与ADM合用后上调了 HepG2/IR细胞内Bax/Bcl-2比率,从而产生协同促进HepG2/IR细胞凋亡的效应。7.ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞周期分布的影响与ADM单用相比,ROSI和ADM合用对HepG2/IR细胞周期分布无显著影响。8.ROSI与ADM合用抑制HepG2/IR细胞迁移划痕实验结果显示,HepG2/IR细胞迁移率较HepG2细胞显著上升。ROSI与ADM合用组比ADM单药组更加明显地抑制了 HepG2/IR细胞的迁移,迁移率在24小时时从ADM单药组的30.42%下降到ROSI与ADM合用组的16.92%。Western blotting实验结果显示,ROSI与ADM合用组与空白组和ADM单药组相比,MMP-2的表达水平显著下降。说明ROSI与ADM合用可能通过降低MMP-2蛋白表达来抑制HepG2/IR细胞的迁移能力。9.ROSI和ADM合用对HUVEC血管生成的影响划痕实验和小管形成实验结果显示,ROSI不能增加ADM对HUVEC迁移和管状结构生成的抑制作用。10.ROSI与ADM合用下调HepG2/IR细胞内AKT/mTOR信号通路ROSI和ADM合用能协同地下调HepG2/IR细胞中的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达水平,提示两药合用后通过抑制Akt/mTOR通路来增强ADM抑制HepG2/IR细胞增殖的作用。11.胰岛素抵抗动物模型的建立与DXMS诱导组相比,高糖高脂饲料喂养4周并腹腔注射80mg/kg STZ通过增加小鼠体重、FBG、FINS、OGTT、HOMO-IR水平成功诱导小鼠胰岛素抵抗模型。12.ROSI与ADM合用显著抑制胰岛素抵抗小鼠体内H22细胞移植瘤的生长小鼠体内实验结果表明,单用ROSI(4mg/kg)和ADM(2mg/kg)6天的抑瘤率分别为23.18%和58.54%,两药合用组的抑瘤率增至76.14%,同时,两药合用还可明显降低胰岛素抵抗小鼠的FBG水平。小鼠移植瘤实验结果表明,两药合用可协同抑制胰岛素抵抗小鼠体内H22的生长,同时降低胰岛素抵抗小鼠空腹血糖水平;另外,各实验组中小鼠给药后均未影响小鼠的体重、心脏、肝脏指数,说明药物对小鼠无明显的毒副作用。实验结论:1.11μmol/L胰岛素诱导HepG2细胞48小时可建立胰岛素抵抗HepG2/IR细胞模型。2.与HepG2细胞相比,HepG2/IR细胞对化疗药物的敏感性降低,其中对ADM的敏感性下降最大。ROSI和ADM合用可协同抑制HepG2/IR细胞的增殖。并且对人正常细胞HUVEC和HL-7702无明显细胞毒作用。ROSI显著增强ADM抑制细胞增殖作用可能与抑制HepG2/IR细胞Akt/mTOR通路有关。3.与HepG2细胞相比,HepG2/IR细胞中的酸性自噬泡数量明显增多,说明细胞自噬水平显著提高。ROSI和ADM合用可抑制HepG2/IR细胞中的酸性自噬泡数量,并降低HepG2/IR细胞内自噬相关蛋白MAP1LC3B2和EGFR/ERK信号通路分子蛋白的表达水平。4.ROSI增强了ADM诱导HepG2/IR细胞凋亡的作用,可能与诱发线粒体凋亡通路中Bcl-2的下调和Bax的上调有关;两药合用通过下调MMP-2协同抑制HepG2/IR细胞迁移。5.对昆明小鼠高糖高脂饲料喂养4周并腹腔注射80mg/kg STZ可诱导胰岛素抵抗动物模型。两药合用对胰岛素抵抗状态下的小鼠肝癌H22移植瘤有明显的协同生长抑制作用,同时降低了胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖水平。