论文部分内容阅读
血红素加氧酶（又称为血红素氧合酶，Heme/Haem oxygenase，HO，EC1.14.99.3）是血红素(heme/haem)降解代谢过程中的限速酶，广泛分布于动物、植物和微生物中。在还原剂(NADPH/FNR/Fd)的作用下，HO能将血红素氧化分解为胆绿素Ⅸα(BiliverdinⅨα，BV-Ⅸα)、一氧化碳(Carbon monoxide，CO)和亚铁离子(Ferrousion，Fe2+)。目前，对植物HO-1基因的探讨和研究已经较为深入。大量的药理学（激活剂和抑制剂）和遗传学（过表达或干扰相关基因）证据表明，HO-1不仅参与了植物光形态建成、侧根与根毛的发育、叶片气孔开闭等生理过程，还与植物响应激素和非生物胁迫有关。然而，通过分析HO-1启动子序列中的调控元件来阐述HO-1基因调控机制的研究还比较少。 糊粉层是谷类作物中的营养组织，在谷类作物种子萌发的过程中起着重要的作用。已有的研究发现，HO-1、钴、赤霉素(GA)和过氧化氢(H2O2)都与谷物糊粉层的细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)有关。然而，HO-1与钴、GA、H2O2参与调控的小麦糊粉层PCD之间的相互关系尚不十分明确。 为了研究拟南芥HY1(HO-1)启动子的表达特征，我们克隆了长约1.8kb的HY1启动子序列(pHY1，-1666到+132)及其一系列的启动子5和3缺失片段(5D1，-1528到+132;5D2，-1109到+132;5D3，-688到+132;5D4，-169到+132;3D1，-1666到+100;3D2，-1666到-1;3D3，-1666到-170）;将所有克隆到的启动子片段融合到GUS（β-glucuronidase）基因的上游后，用浸花法转化拟南芥。获得的转基因植株用于分析外界胁迫（尤其是低盐、缺铁和Hg胁迫）对启动子活性的影响。结果表明:启动子中由+1到+100区间的5-非翻译区序列对HY1启动子的基本活性起着关键作用;-1666到-689区间的启动子序列对启动子的活性有增强作用，启动子的序列越长，则启动子活性越强;而-688到-170的启动子区间存在着起到负调节作用的顺式作用元件。随着启动子的5端序列缺失至-688，启动子的基本活性及其受低盐胁迫和过氧化氢(H2O2)处理的诱导活性都逐渐减弱，这种诱导能力的减弱与启动子上MBS(-1542、-1333、-1078和-177)元件数量的减少呈相关性;不合MBS元件的启动子片段5D4(-169到+132)尽管具有较高的基本活性，却完全失去了低盐胁迫和过氧化氢(H2O2)处理的诱导活性。因此，我们认为，HY1启动子序列中分布的MBS元件对盐胁迫诱导的HY1表达上调起着重要的作用，并且这个过程H2O2由介导。另外，我们还发现，启动子-169到-1区段和-688到-170区段可能分别是HY1启动子响应缺铁和Hg胁迫的调节区域。总之，我们的研究丰富了对拟南芥HY1基因转录调控机制的认识。 在进一步的研究中，我们发现:1）50μM CoCl2和CoPP预处理都能缓解GA诱导的PCD，影响内源H2O2的含量;2）100μMH2O2预处理能提高GA处理后小麦糊粉层细胞的存活率，同时提高HO-1的表达量;3）H2O2产生抑制剂(diphenyleneiodonium，DPI)抑制了CoCl2和CoPP对小麦糊粉层PCD的缓解作用和对HO-1表达的诱导作用。上述结果表明:HO-1参与钴缓解GA诱导的小麦糊粉层PCD，H2O2可能是其信号分子。