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背景细菌耐药是一个极为复杂的问题,应该从多个方面给与重视,其中临床上给药剂量的不规范是导致细菌耐药的一个重要因素。1999年突变选择窗理论的提出恰恰解决了这一问题,该理论认为：耐药突变体亚群在应用抗菌药物治疗之前已经存在,而在应用抗菌药物治疗时,如果抗菌药物的浓度位于突变选择窗(mutant selection window, MSW)之间,耐药突变体会选择性富增,MSW的上界值为防耐药突变浓度(mutant prevention concentration, MPC)。因此,关闭或者缩小MSW可以较少细菌发生耐药突变的机会。当两种不同作用机制的抗菌药物联合应用,并同时处于各自的MIC之上时,细菌需要同时发生两种耐药突变才能生长从而关闭MSW,从而有效控制细菌耐药。目的在体外和动物体内探讨抗菌药物的联合应用能否缩小细菌对单药的耐药突变选择窗,能否有效控制细菌耐药。同时观察突变选择窗内细菌的耐药机制。方法1.体外试验：选择铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌三种细菌的标准菌株进行试验。1.1铜绿假单胞菌：选择头孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)和环丙沙星(CTP)为试验药物,分别应用琼脂平板稀释法和棋盘格法测定单药以及两两联合联合之后的MIC。琼脂平板稀释法测定单药及两两联合时对铜绿假单胞菌的防耐药突变浓度MPC,并计算选择指数SI(MPC/MIC),观察能否缩小突变选择窗。1.2金黄色葡萄球菌：分别应用E-test与琼脂平板稀释法测定万古霉素对金黄色葡萄球菌的MIC与MPC,同时应用棋盘格法和琼脂平板稀释法测定联合左氧氟沙星与利福霉素后万古霉素的MIC与MPC,并计算选择指数SI,观察能否缩小突变选择窗。1.3大肠埃希菌：选择环丙沙星(CIP)与阿米卡星(AMK)为试验药物,分别应用琼脂平板稀释法和棋盘格法测定单独以及联合之后的MIC,琼脂平板稀释法测定单独及联合时对大肠埃希菌的防耐药突变浓度MPC,并计算相应的选择指数SI,观察能否缩小突变选择窗。2.耐药机制的初步分析：选择铜绿假单胞菌为代表,观察主动外排系统在突变选择窗内细菌耐药所起的作用。2.1 E-test测定美罗培南(MEM)、头孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)四种抗铜绿假单胞菌药物单药MIC。2.2棋盘格法测定联合利血平、奥美拉唑、阿奇霉素、CCCP、PAβN五种外排抑制剂后抗菌药物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度MIC。2.3琼脂平板二倍稀释法测定抗菌药物单药以及联合外排抑制剂后防耐药突变浓度(MPC),并计算相应的选择指数SI。同时用美罗培南、头孢他啶、环丙沙星分别联合阿米卡星,阿米卡星联合环丙沙星,分别测定联合前后的SI,比较联合抗菌药物与联合外排抑制剂在防铜绿假单胞菌耐药突变的能力,分析主动外排系统在突变选择窗内细菌耐药所起的作用。3.动物实验：在家兔体内观察环丙沙星联合妥布霉素后,能否降低环丙沙星对铜绿假单胞菌的防耐药突变浓度,控制细菌耐药。3.1建立兔组织笼感染模型3.2高效液相色谱法测定环丙沙星在兔组织液中药代动力学参数3.3试验分组：55只家兔随机分为11组,1组为生理盐水组最为对照,5个组为单用环丙沙星,其余5个组为环丙沙星联合妥布霉素,每组5只家兔。每只均注入1010cfu/ml浓度的铜绿假单胞菌ATCC27853 lml,3.4给药方案：环丙沙星按照药代动力学参数设计给药方案,一天内10次给药,每次给药间隔2小时,使单药组与联合组家兔血环丙沙星稳态浓度分别均达到1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC浓度,联合组妥布霉素给药方案参照参考文献,是其稳态浓度均达到其2-4MIC浓度,治疗三天,抽取组织液,稀释后涂布琼脂平板,观察耐药突变体生长情况。结果：1体外实验：1.1铜绿假单胞菌：CIP、AMK、CAZ单药对铜绿假单胞菌的SI分别为16、16、>32。两两联合后各自单药的SI分别为：CIP+AMK (CIP-8;AMK-4); CIP+CAZ (CIP-4;CAZ-8); AMK+CAZ(AMK-8;CAZ-4).1.2金黄色葡萄球菌：万古霉素对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC以及S工分别为1.0μg/mL、51.2μg/mL、51.2,万古霉素分别联合利福霉素与左氧氟沙星后的MPC及SI分别为12.8μg/mL、25.6; 8.0μg/mL、16.0。1.3大肠埃希菌：CIP、AMK单药对大肠埃希菌的SI分别为16和32。两者联合应用时,当AMK浓度达到2MIC、CIP达到其2MIC时便可抑制耐药突变体产生。联合后的SI分别为8(0.008／0.001)和8(2／0.25)。2耐药机制的初步分析：MEM、CAZ、AMK、CIP四种抗菌药物单药的SI分别为>32,>32,16,16; MEM、CAZ、AMK、CIP与利血平联合后SI分别为16、16、16、8；与奥美拉唑联合后分别为16、32、16、8；与阿奇霉素联合后分别为8、16、16、8；与CCCP联合后分别为8、8、16、8；与PAβN联合后分别为8、16、16、8。MEM、CAZ、CIP分别与AMK联合后的SI分别为4、4、8。阿米卡星与环丙沙星联合后阿米卡星的SI为4。3动物实验：3.1单用环丙沙星组：1MIC、2MIC、4MIC、8MIC组家兔组织液中均有耐药突变体的生长,随浓度提高,菌落数逐渐减少,16MIC组没有耐药突变体生长。3.2环丙沙星联合妥布霉素组：环丙沙星浓度为1MIC、2MIC组有耐药突变体生长,4MIC、8MIC、16MIC组没有耐药突变体的生长。结论体外体内试验证实,两种抗菌药物联合应用可以缩小细菌药耐药突变选择窗,减少耐药突变体产生的机会,从而有效控制细菌耐药。抗菌药物与外排抑制剂联合可以缩小突变选择窗,但作用弱于两种抗菌药物联合,从而推测突变选择窗内富集扩增的耐药菌,在高于MIC浓度的抗菌药物压力下,主动外排系统只有少量激活,也没有新的外排系统的产生。