【背景与目的】肝细胞肝癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,病程进展快,病死率逐年攀升。在我国乙型肝炎病毒(HBV)的感染是HCC最主要的病因之一。HCC早期症状隐匿,中、后期治疗效果差,预后不良。迄今为止,灵敏度或特异度不足是HCC诊断标志物存在的普遍问题,虽然近年也有一些新的血清学标志物的研究,但在临床应用上仍有一定的局限性,用于对慢性HBV感染发展到HBV相关性肝癌的疾病进程进行预测就更难以实现。因此,急需寻找与HBV慢性感染到癌变过程密切相关的,有较高特异性和敏感性的血清学标志物,并探讨其调控作用。这将有助于临床上HCC患者的早期发现和治疗,并对改善肝癌患者的预后,提高生存率具有重要意义。microRNAs(miRNAs)是一类长度约22nt的内源性单链非编码RNA小分子,可以对基因进行转录后调控。研究发现miR-375在各种恶性肿瘤中呈低表达,它的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。miR-375对肝癌细胞的增殖、侵袭有抑制作用,但缺乏进一步的流行病学现场研究来分析mir-375在健康人群、hbv慢性感染者、肝硬化到hbv相关性肝癌发生、发展过程中的表达水平;血清中和肝癌组织中mir-375的差异表达与患者hbv血清标志物、肝癌相关的临床检测指标等的相关性如何也未见报道。因此,本研究以现场研究和实验室研究相结合,检测从健康人群、慢性乙肝感染、肝硬化发展到乙肝相关肝癌进程中血清mir-375的差异表达,分析血清和肝癌组织中mir-375表达水平与疾病进展、肝癌临床检测指标、hbv感染相关指标等的相关性;同时在hepg2细胞平台上,通过mir-375增强表达探讨其对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。本研究将进一步阐明肝癌发展的分子调控网络,为肝癌的疾病进展的预测提供线索。【方法】1.人群肝癌组织实验部分:于2014年8月至2015年8月在西京医院收集进行手术治疗的hbsag阳性hcc患者为研究对象,采集患者肝癌组织和癌旁正常组织进行实验。利用自行设计调查表收集研究对象人口学信息和临床资料,通过qrt-pcr对组织mir-375进行检测,使用elisa法检测乙肝五项。分析比较肝癌组织与癌旁正常组织mir-375表达水平的差异,以及肝癌组织mir-375表达水平与肿瘤分期、大小、数目、常用肿瘤标志物以及hbv血清标志物等之间的相关性。2.人群血清研究部分:2014年10月至2015年2月,在唐都医院感染科收集hbv相关性疾病患者;同期于第四军医大学校直门诊部收集健康对照;并且将第一部分hbv相关性hcc患者的血清学标本也纳入研究。采集血液标本,使用统一调查表收集基本信息和临床资料,通过qrt-pcr检测mir-375和hbvdna,使用elisa法检测乙肝五项。比较健康对照、慢性乙型肝炎无肝硬化患者、肝硬化患者以及hbv相关性肝癌患者的血清mir-375表达水平的差异,分析其与患者hbv血清标志物、肝癌临床检测指标等的相关性,并绘制roc曲线,分析mir-375对hbv相关性hcc的诊断效能。3.细胞研究部分:选择能够稳定复制hbv的肝癌细胞hepg2.2.15和其亲本hepg2进行实验,通过qrt-pcr检测两株肝癌细胞mir-375表达水平的差异。利用体外转染mir-375mimic上调其表达,采用cck-8法、细胞划痕实验和transwell实验分析mir-375的过表达对hepg2和hepg2.2.15细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4.统计学分析:采用epidata3.1软件建立数据库,使用spss19.0分析数据,计量资料使用t检验、方差分析或mann-whitneyu检验进行统计分析,计数资料使用卡方检验进行统计分析,相关性使用spearman相关性分析,p<0.05为有统计学意义。【结果】1.人群肝癌组织实验部分:纳入hbv相关性hcc研究对象43例,肿瘤数目平均为1.24±0.58个,肿瘤大小平均为5.99±2.58cm。(1)hbv相关性肝癌患者肝癌组织中mir-375表达水平显著低于癌旁组织(p<0.001)。(2)分析肝癌组织mir-375的表达与hbv血清学标志物的相关性结果显示:hbvdna阳性的患者肿瘤组织mir-375的表达水平显著低于hbvdna阴性患者(p<0.05);抗-hbc阳性患者肝癌组织中mir-375的表达水平显著低于抗-hbc阴性患者的水平(p<0.001)。(3)肝癌组织mir-375的表达与hcc患者临床特征分析结果显示:男性患者肝癌组织mir-375的表达水平显著低于女性患者(p<0.05);存在肝硬化的hcc患者肝癌组织mir-375的表达水平显著低于无肝硬化的hcc患者(p<0.05);ca19-9出现升高的hcc患者肝癌组织中mir-375的表达水平显著低于ca19-9正常的患者(p<0.05)。2.人群血清研究部分:纳入研究对象177例,其中健康对照40例,慢性乙型肝炎无肝硬化患者20例,hbv肝硬化患者54例,hbv相关性hcc患者63例。(1)健康人群血清中mir-375的表达量最高,而慢性乙型肝炎无肝硬化患者、肝硬化患者和hcc患者的血清mir-375水平依次降低。(2)分析血清mir-375的表达与hbv血清学标志物的相关性结果显示:血清mir-375在hbeag阳性患者中的表达水平显著低于阴性患者(p<0.05);抗-hbe阴性患者血清mir-375表达水平显著高于抗-hbe阳性的患者(p<0.05);血清mir-375在hbvdna阳性患者中的表达水平显著低于hbvdna阴性的表达水平(p<0.05)。(3)分析血清mir-375的表达水平与hbv相关性患者肿瘤标志物的相关性,结果显示:血清mir-375在afp和cea阳性患者中表达水平均低于阴性患者(p<0.05)。(4)绘制roc曲线,结果显示:mir-375从全部研究对象中诊断出hbv相关性hcc患者的灵敏度为73.9%,特异度为93.0%,auc为0.838(95%ci:0.780~0.897);分别使用mir-375和afp从hbv相关性疾病患者中诊断出hcc患者,前者灵敏度为93.8%,特异度为63.9%,auc为0.768(95%ci:0.644~0.891),后者灵敏度为75.0%,特异度为65.5%,auc为0.584(95%ci:0.456~0.713)。3.细胞研究部分:(1)与HepG2细胞相比,mi R-375在表达HBV全基因组的HepG2.2.15细胞中呈现低表达(P<0.05)。(2)CCK-8实验结果显示:细胞miR-375过表达后的增殖速度小于未转染的细胞;转染和未转染的HepG2.2.15细胞的增殖速度均小于转染和未转染的HepG2细胞。(3)划痕实验结果显示:与转染细胞相比,未转染的肝癌细胞出现迁移现象;转染后的HepG2.2.15细胞形态发生变化,贴壁能力比转染后的HepG2细胞弱。(4)Transwell实验结果显示,转染上调miR-375的细胞侵袭数目明显少于未转染细胞;分析转染后的HepG2和HepG2.2.15细胞侵袭数目,发现过表达后,HepG2细胞侵袭细胞数目高于HepG2.2.15细胞。【结论】1.HBV相关性HCC患者肿瘤组织中miR-375的表达显著低于癌旁正常组织,肿瘤组织miR-375的表达水平与抗-HBc以及HBV DNA滴度呈负相关关系。2.健康对照者血清miR-375的表达水平最高,随着HBV相关疾病进程的发展,血清miR-375的表达水平逐渐降低,在HBV相关性HCC患者血清中达到最低水平,这将为肝癌的疾病进展的预测提供重要线索。血清miR-375的表达水平与HBeAg、抗-HBe、HBV DNA、AFP以及CEA存在相关性。3.血清miR-375可以作为肝癌的辅助诊断指标,对HBV相关性HCC患者的检出具有较高灵敏度和特异度。4.与HepG2细胞相比,miR-375在HepG2.2.15细胞中呈下调表达。通过体外miR-375的增强表达,miR-375能够有效地影响HBV的复制,并抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,发挥着类似抑癌基因的作用。