论文部分内容阅读
目的:研究丝光绿蝇(Lucilia sericata)在吗啡(morphine)作用下的发育变化情况,探索实验指标与时间的规律性变化,从而为死后间隔时间(Postmortem interval,PMI)的推断和法医昆虫毒理学(forensic toxicologic entomology)提供参考依据。方法:在河北医科大学校园内以大鼠内脏诱捕丝光绿蝇,带回实验室,在培养箱内连续饲养,以第三代作为母代观察其在吗啡影响下的发育。本实验共使用家兔4只,随机分为对照组和实验组。对照组家兔经耳缘静脉注射生理盐水1ml/kg,实验组家兔经耳缘静脉依次注射0.5倍、1.0倍、2.0倍致死剂量的吗啡[1,2],给药30min后将4只家兔处死,处死方法均为重击其枕部迅速致死。取家兔的肌肉组织分别保存,对照组标记为M0,实验组依照给药浓度从小到大依次标记为M1、M2、M3。设定生化培养箱温度为28℃,相对湿度为75%,光照周期为12h:12h。用新鲜猪肝诱丝光绿蝇产卵,产卵时间记为零时,将卵块移至家兔的肌肉组织上饲养。幼虫孵出12小时后,每隔12小时留取标本一次,每组每次留取20头幼虫,直至幼虫达到离食期。将每组每次留取的10头幼虫用70℃热水烫死,然后放入浓度为70%的酒精中保存;其余10头幼虫用蒸馏水洗净数次,滤纸吸干,置于-70℃冰箱保存备用。1头咽骨形态学观察及测定从保存液中取出幼虫标本后,吸干表面液体,放在培养皿上,用大头针在幼虫腹部一侧扎几个小孔,放入10%的KOH溶液中消化内部组织,24h后将幼虫从KOH溶液中取出,放在培养皿上用镊子轻轻按压幼虫,直至将体内已消化的组织排出。幼虫在清水中洗净数遍后,在体视显微镜下分离出幼虫的头节,然后将头咽骨进行对称分离标本依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中逐级脱水,最后用二甲苯透明,显微镜下整姿后滴加拿大树胶封片,置于阴凉处风干。光学显微镜下观察、拍照。利用计算机图像分析系统对头咽骨的口钩及咽骨的面积、骨化面积和平均光密度等多项指标进行测定。2蛋白质的测定从-70℃冰箱中取出幼虫标本,每组每日龄幼虫各取10头,分别在液氮中充分研磨后加入500μl PBS(pH7.4)溶液,12000rpm离心10min,取上清即为粗提液。取粗提液,根据Bradford比色法测定其OD值,标准曲线用0.5mg/ml牛血清蛋白制作,利用标准曲线方程计算出样品中蛋白质含量。各组头咽骨的各项形态学指标、蛋白质含量均采用均数±标准差表示,各组最大值或最小值间比较应用单因素方差分析(one way ANOVA),分析结果由SPSS16.0软件处理得出,以P<0.05为显著性差异有统计学意义,应用Excel程序作图。结果:1头咽骨形态学特征1.1在恒定温度下随着幼虫的发育,丝光绿蝇幼虫头咽骨的颜色变化依次为淡黄色、棕褐色、黑褐色,几丁质化程度不断加强,骨化的范围不断增大。丝光绿蝇幼虫无附口骨。1.2在M0、M1、M2、M3组中,幼虫口钩的面积随时间的延长呈阶段性增加,龄期更替时变化显著,尤以二、三龄期更替时最显著。各组幼虫孵出12h时口钩面积为最小,各组口钩面积最小值之间无明显差异(P>0.05); M1、M2、M3组幼虫口钩面积均于48h达到最大值,M0组于60h达到最大值,各组幼虫口钩面积达到最大值后,随时间的延长基本维持不变。幼虫口钩的骨化面积和平均光密度的变化趋势与口钩面积变化趋势相似,但骨化面积和平均光密度在一、二龄期内的变化趋势较口钩面积的变化显著。各组幼虫孵出12h时口钩骨化面积和平均光密度均为最小;M0、M1、M2、M3各组口钩的骨化面积和平均光密度达到最大值的时间分别为72h、60h、48h、48h。说明随着药物浓度的增加幼虫生长速度是增快的。在供试的四组中,口钩面积、口钩骨化面积、口钩平均光密度三项指标各自最大值之间无明显差异,说明盐酸吗啡没有对口钩各项指标的最大值产生显著影响。1.3在M0、M1、M2、M3组中,每组幼虫孵出12h时咽骨面积值为最小,各组最小值之间存在显著性差异(P<0.05),说明在幼虫最初摄食的过程中药物即对其产生了影响;随着药物浓度的增加咽骨面积也在增加。各组幼虫咽骨面积均于48h达到最大值,各组咽骨面积M0<M1<M2<M3,咽骨面积最大值之间存在显著性差异(P<0.05)提示盐酸吗啡增加了幼虫的最大咽骨面积。在M0、M1、M2、M3组中,每组幼虫孵出12h时咽骨骨化面积值均为最小,并且M0<M1<M2<M3 ,各组骨化面积最小值之间存在显著性差异(P<0.05);幼虫咽骨骨化面积达到最大值的时间分别为120h、120h、96h、84h,说明咽骨骨化面积的发育随药物浓度的增加而增快,浓度越高达到最大骨化面积的时间越短;同时分析数据显示四个组中咽骨骨化面积最大值的变化关系为:M0<M1<M2<M3,咽骨骨化面积最大值之间存在显著性差异(P<0.05),提示盐酸吗啡增大了幼虫最大骨化面积。幼虫咽骨骨化面积的变化趋势与咽骨平均光密度的变化趋势相同,二者随幼虫发育时间的延长呈现持续性增加的趋势,并一直保持到三龄结束,是推测PMI的理想指标。2蛋白质含量的变化实验结果显示:蝇类幼虫的蛋白质含量变化呈S型,是一个连续变化的过程。一龄、二龄增长迅速,不同实验组蝇类幼虫随着发育在三龄后变化均不明显。四个组蛋白质含量的变化趋势:M0=M1<M2<M3,且最大值之间存在显著性差异(P<0.05) ,提示随着药物浓度的增加使蝇幼虫的蛋白质含量有所增加,并且盐酸吗啡使蝇幼虫的蛋白质含量最大值有所增加。结论:1幼虫口钩的面积、平均光密度和骨化面积随时间的延长而增加,龄期更替时变化显著,但进入三龄达到最大值后变化不明显。盐酸吗啡对口钩各项指标的影响不明显。2幼虫咽骨面积的变化趋势与口钩面积的变化趋势相同。随时间的延长咽骨骨化面积和平均光密度呈现持续性增加的趋势,并一直保持到三龄结束,是推测PMI的理想指标。3盐酸吗啡增大了咽骨面积、咽骨骨化面积、咽骨平均光密度三项指标的最大值;在药物影响下,咽骨骨化面积和咽骨平均光密度的发育随药物浓度的增加而增快,浓度越高达到咽骨骨化面积最大值和咽骨平均光密度最大值的时间越短。4蝇类幼虫的蛋白质含量变化呈S型,是一个连续变化的过程。各组蛋白质含量在幼虫摄食初期随时间的延长呈增长趋势,当到达最大值后变化不明显。但各组到达最大值的时间随着药物浓度的增加而缩短,并且盐酸吗啡增大了幼虫体内蛋白质含量的最大值。差异有统计学意义(P<0.05)。