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香榧(Torreya grandis)为我国特有的珍贵多用途经济树种,其种子为著名的干果,全身都是宝,经济价值非常高。香榧是我国近年来发展最快、经济效益最好的经济林树种之一,优良无性系品种越来越多。但由于良种枝条和苗木的缺乏,一些不法之徒以次充好,以假冒真的事件在各地时有发生,因此鉴别香榧优良品种已成为当前香榧生产和良种化过程中急需解决的迫切问题。香榧的品种分类研究仍限于形态学、解剖学的方法,有关香榧在DNA水平上的分类研究尚未见报道。本实验试图利用RAPD技术对香榧主要栽培品种进行系统聚类分析,并进行品种种类的划分和分子鉴别,为更加深入地研究这一珍贵树种发挥其潜在的巨大经济价值提供依据。 本实验利用香榧种子胚乳DNA来进行RAPD分析。共有8个品种,分别为:茄榧、旋纹榧、大圆榧、小圆榧、细榧、米榧、芝麻榧、冲杠榧。采用改良的CTAB法对香榧种子胚乳DNA进行抽提。将抽提出来的DNA溶于TE缓冲液中,利用Du-640核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度。结果表明,所抽提的香榧种子胚乳DNA样品中,DNA浓度较高,但仍含有较多的蛋白质等杂质,而且DNA的纯度不高,但由于RAPD分析对模板DNA的纯度要求不高,所抽提的DNA样品完全能满足RAPD分析的需要。 为了提高RAPD分析的重复性,在实验过程中对RAPD分析的各个步骤都进行了反复的摸索,特别是对RAPD的反应体系和循环条件进行了优化,最后得到了较优的适合于香榧种子胚乳DNA进行RAPD分析的反应条件。其中RAPD反应体系为:10ng/μl DNA template 2.0μl;10x buffer 1.5μl;2mM dNTPs 1.8μl;25mM MgCl2 1.44μl;10μM primer 1.26μl;5U Tag polymerase0.2μl;ddH2O 6.8μl;total 15μl。RAPD-PCR循环条件为:95℃变性3min,一个循环;94℃变性30s,36℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸5min,反应终止。 从520种随机引物种筛选出23种引物,对香榧8个主要栽培品种进行RAPD分析,产生了80个标记位点,并在此基础上得到了香榧8个主要栽培品种的标记基因型,并以此标记基因型进行分子鉴别。将香榧的标记基因型剖分成0、1、2型三组数据,采用模糊聚类分析软件进行分析,对香榧8个主要栽培品种进行分子分类,并将其分为两大类。