研究背景乳腺癌已成为严重危害妇女健康的恶性肿瘤,全球每年新增接近130万乳腺癌患者,大约有40万人因乳腺癌死亡。在中国,我们面临的形势同样非常严峻,乳腺癌患者每年的死亡数量和新发数量分别占全世界的9.6%和12.2%,乳腺癌目前已成为中国女性发病率最高的恶性肿瘤,在癌症死亡原因中位居第六。近年来围绕乳腺癌发病机理的研究已取得了一定的成绩,且针对部分乳腺癌相关的靶点也已研制出相应的靶向治疗药物,并用于临床治疗,但是疗效尚不能令人满意,需要进一步深入研究乳腺癌的发病机制。MicroRNAs是一类内源性非编码小RNA,长度约19-25个核苷酸序列,它通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区结合,参与基因转录后表达调控,进而调控细胞增殖、凋亡、分化、代谢等生物学作用。miRNA已被证明在心血管疾病、神经系统疾病以及肿瘤的发生发展中起到重要的作用。miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中可能扮演关键的角色,可以作为原癌基因或抑癌基因发挥作用。目前研究发现多个miRNAs包括miR-31, miR-205, miR-335, miR-200 family, miR-124, miR-340和miR-196s具有肿瘤抑制基因的功能,已经证明在乳腺癌中表达下调。然而,miR-10b, miR-373, miR-520c, miR-9和miR-221/222在乳腺癌发生和发展中起到原癌基因作用。miR-409-3p位于染色体14q32.31,与肿瘤的形成及进展有关。研究发现miR-409-3p可以促进胃癌细胞的增殖、凋亡,抑制肿瘤的侵袭和转移,同样还发现,miR-409-3p在膀胱癌、肺癌及结肠癌中起到肿瘤抑制因子的作用,但是它在乳腺癌中扮演的角色仍然不清楚。研究目的研究miR-409-3p在乳腺癌细胞和组织中的表达特性,探讨miR-409-3p对乳腺癌细胞生物学特性的影响及其在乳腺癌中所发挥的生物学作用机制,为深入了解乳腺癌发病的分子机制和寻找新的分子治疗靶点奠定理论基础。研究方法1.组织样本收集与细胞培养收集30例新鲜的乳腺癌组织及其癌旁正常组织,液氮中速冻。乳腺癌细胞系MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, T47D及人正常乳腺上皮细胞系HBL-100均培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于5% CO2、37℃及湿度饱和的环境中培养。2.慢病毒生产和转导扩增miR-409-3p序列,并克隆到HU6-MCS-PGK-EGFP慢病毒载体,感染293T细胞,获得稳定表达miR-409-3p的病毒颗粒,并进一步转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞,用于后续实验。3.RNA提取与实时定量PCR分析使用TRIzol试剂从组织和培养的细胞中提取总RNA。 RNA标本中加入miRNA特异性的RT引物(茎环结构的),进一步逆转录为cDNA。SYBR Green掺入法荧光定量PCR测定miR-409-3p或AKT1 mRNA表达水平,U6或β-actin作为内参。使用2-ΔΔCt方法进行数据分析。4. Western blot参考文献中Western blot实验步骤,裂解细胞收集蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离全部蛋白,并转膜,后将膜加入Aktl或p-Akt1一抗孵育,然后洗涤和暴露在HRP标记的二抗中,GAPDH作为内参。最后经化学发光试剂处理,观察结果。Western blot用来检测细胞或裸鼠肿瘤组织中Akt1蛋白表达水平。5.质粒构建和转染克隆AKT1的开放读码区(不含3’UTR)至表达载体pcDNA3.1质粒中,然后转染至miR-409-3p稳定表达的MDA-MB-231细胞进行“营救”实验。在荧光素酶实验中,将野生型或突变型AKT1的3’UTR扩增并克隆到的pGL3荧光素酶报告基因载体中,使用QuickChange定向突变试剂盒将靶位点3’UTR突变。使用脂质体2000试剂进行质粒的转染。6.细胞增殖和克隆形成实验MTT实验：收集细胞接种于96孔板,分别培养1,2,3,4和5天。其后,在每个时间节点上向每孔加入MTT溶液,使用酶标仪测定在490nm处吸光度。平板克隆形成实验：收集细胞接种于6孔板,培养14天,克隆用30%的甲醛固定,用结晶紫染色液染色。用光学显微镜进行克隆计数。7.细胞迁移与侵袭实验按照Transwell说明书进行操作,用不含Matrigel胶的Transwell实验检测细胞迁移,用含Matrigel胶的Transwell实验检测细胞的侵袭。24小时后,穿到下室的细胞被固定、染色。在高倍镜下随机选取5各视野进行细胞计数。8.体内成瘤试验将表达miR-409-3p的MDA-MB-231细胞和阴性对照细胞接种到裸鼠右侧腋下。每4天测量肿瘤生长的直径。28天后,将小鼠安乐死,测量最终肿瘤的重量及体积。选取一部分肿瘤组织,应用western blot检测Aktl,免疫组化法检测Ki-67。9.双荧光素酶报告基因检测验证靶基因将野生型或突变型Aktl-3’UTR表达载体与hU6-miR-409-3p或空白质粒转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞,应用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。10.统计分析所有试验至少独立重复三次。所有的数据使用均数±标准差进行统计描述。统计分析使用SPSS 13.0软件。不同组之间使用t检验(双侧)进行比较。差异显著性设为P<0.05。结果1.miR-409-3p在乳腺癌组织及细胞系中表达下调为探究miR-409-3p在人类乳腺癌中的作用,我们首先检测miR-409-3p在乳腺癌细胞系MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, T47D及乳腺癌上皮细胞系HBL-100中的表达水平。与HBL-100相比,所有检测细胞系中miR-409-3p的表达均下调,但下调的程度不一。同时,miR-409-3p在乳腺癌组织中较正常癌旁组织表达显著降低。这些结果表明miR-409-3p的下调可能参与乳腺癌的发生、发展。2. miR-409-3p抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭为探究miR-409-3p在乳腺癌细胞增殖中的影响,我们应用慢病毒转染的方法构建miR-409-3p稳定表达的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系。首先应用MTT比色法评估miR-409-3p对细胞生长的影响,结果显示,miR-409-3p转染细胞的生长被显著抑制。然后行平板集落形成实验进一步评价miR-409-3p对乳腺癌细胞克隆形成的影响,结果显示,转染miR-409-3p的乳腺癌细胞集落形成能力显著降低。这些结果表明miR-409-3p抑制乳腺癌细胞的增殖。另外在Transwell实验中,miR-409-3p过表达可显著抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。这些数据表明miR-409-3p在乳腺癌中起到肿瘤抑制作用。3. miR-409-3p抑制裸鼠肿瘤移植物生长为检测miR-409-3p对体内肿瘤生长的影响,分别将稳定表达miR-409-3p和阴性对照的MDA-MB-231细胞皮下注射到小鼠右侧腋下,28天后,将小鼠处死收集肿瘤。结果显示：miR-409-3p过表达组肿瘤生长速度最慢。另外,较对照组相比,肿瘤重量及Ki-67阳性细胞在miR-409-3p稳定表达组中显著降低。体内实验结果表明miR-409-3p可抑制乳腺癌肿瘤移植物的生长。4.原癌基因AKT1是miR-409-3p的一个直接下游靶点(1)为了解miR-409-3p如何在乳腺癌中发挥其作用,我们利用TargetScan和miRanda两个独立的数据库寻找它的靶向基因,并考虑到对乳腺癌病理生理过程的影响,最终AKT1被确定为候选靶基因。为确定AKT1是miR-409-3p的一个直接靶点,我们分别构建了含有野生型AKT1-3’UTR及突变型AKT1-3’UTR的荧光素酶报告基因质粒。然后进行双荧光素酶报告基因检测,实验结果显示：miR-409-3p与野生型AKT1-3’UTR共转染后,荧光素酶活性显著下降,而miR-409-3p与突变型AKT1-3’UTR共转染后,荧光素酶的活性无明显变化。这表明miR-409-3p可直接作用于AKT1的3’UTR, AKT1为miR-409-3p的直接靶基因。(2)在miR-409-3p稳定表达的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中,AKT1 mRNA的表达水平较对照组无统计学差异。而Western blot分析显示MDA-MB-231-miR-409-3p和MDA-MB-468-miR-409-3p稳定表达细胞株中Akt1蛋白水平的表达较对照组明显降低。在转染miR-409-3p抑制剂的T47D细胞系中,Aktl蛋白水平的表达较对照组显著提高。在接种稳定表达miR-409-3p的MDA-MB-231细胞的裸鼠所获得的肿瘤组织中Aktl蛋白水平的表达较对照组明显降低。实验结果表明miR-409-3p可以抑制AKT1蛋白的翻译。5.过表达AKT1可解除miR-409-3p对细胞的增殖、转移及侵袭的影响我们将敲除3’UTR的AKT1质粒转染进入miR-409-3p高表达的MDA-MB-231细胞进行营救实验。结果显示,转染敲除3’UTR的AKT1质粒转染后AKT1表达显著增高。MTT及克隆形成实验显示过表达AKT1能够明显逆转miR-409-3p对细胞增殖及克隆形成的抑制。另外,AKT1的过表达还能够逆转miR-409-3p对细胞转移及侵袭的抑制。总之,营救实验结果提示过表达AKT1能够解除miR-409-3p对细胞的增殖、迁移及侵袭的影响。结论1. miR-409-3p在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中表达下降,提示miR-409-3p在乳腺癌中可能起到肿瘤抑制因子的作用。2.过表达miR-409-3p能够抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。3.体内实验显示过表达miR-409-3p能显著抑制乳腺癌细胞的成瘤能力,表明miR-409-3p在乳腺癌中起肿瘤抑制因子的作用。4. miR-409-3p参与调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移可能是通过抑制靶基因Aktl发挥作用。5.过表达AKT1可解除miR-409-3p对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。