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目的多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种新型的纳米纤维材料,具有优异的导电、导热和力学性能,已广泛应用于蓄电池、船舶、航天器和运动器材等多个领域。此外,MWCNTs特殊的中空结构使得空腔管体容纳生物特异性分子及药物成为可能,良好的生物相容性使其可与蛋白质、核酸、脂质等生物分子相结合;这些特点决定了其可作为药物载体,在生物医药领域也有着巨大的应用前景。因MWCNTs应用前景广泛,人类接触或使用MWCNTs相关产品的机会大大增加,其是否会对人体健康造成危害必然会受到社会的高度关注。目前,对MWCNTs有害效应的研究多集中于职业暴露导致的呼吸系统毒性,而对其它器官或组织的毒性关注不够。作为药物载体,心血管系统是最易受到MWCNTs直接暴露的器官。所以,本研究通过体内和体外实验相结合的方式,分别通过整体动物实验和体外实验系统,考察MWCNTs致血管内皮功能障碍的作用,并探究VEGF在这一损伤效应中的作用。此可明确MWCNTs对心血管系统的毒性效应,探索其作用机制,为MWCNTs产品的安全性评价和风险评估提供科学依据,具有重要的科学意义。材料与方法1、受试物:MWCNTs,长度10-20μm,直径10-50 nm和>50 nm两种。2、实验对象:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和C57BL/6J小鼠。3、受试剂量及染毒方式:(1)HUVECs体外培养:实验组给予MWCNTs剂量为0.1,1,10,100μg/m L。,(2)C57BL/6J小鼠:实验组经尾静脉给予MWCNTs 2 mg/kg,或腹腔注射含有MWCNTs 10μg/m L Matrigel 0.5 m L。4、实验方法与内容(1)通过透射电镜(TEM)明确MWCNTs能否进入HUVECs胞内。(2)通过CCK-8、LDH、Calcein-PI/AM法,考察MWCNTs对HUVECs的损伤作用;通过小管形成实验和细胞划痕实验,考察MWCNTs对HUVECs再生能力和迁移功能的影响。(3)尾静脉给药14天后,取小鼠肺脏、主动脉制作病理切片,考察MWCNTs对小鼠小血管和大血管的损伤作用;通过Matrigel Plug模型,考察MWCNTs对小鼠血管新生能力的影响。(4)通过蛋白芯片技术,考察MWCNTs对HUVECs培养上清液中血管功能相关蛋白表达量的影响;通过ELISA法检测HUVECs培养上清液和小鼠血清中VEGF水平,通过Western-Blot检测VEGF下游AKT、eNOS的表达量变化,从分子水平考察MWCNTs致血管内皮功能障碍作用。(5)向MWCNTs处理组加入重组VEGF,观察HUVECs小管形成能力的变化和小鼠血管再生能力的变化,检测下游AKT、eNOS的表达量变化,考察VEGF在MWCNTs致血管内皮功能障碍中的作用。结果实验结果如下:1、透射电镜结果显示,实验组HUVECs细胞内可检测到MWCNTs存在。2、CCK-8和Calcein-PI/AM检测结果显示,实验组HUVECs细胞活力与对照组相比较,差异具有统计学意义;LDH法显示,100μg/m L组细胞活力与对照组相比较,差异具有统计学意义,表现为活力明显下降;细胞功能实验中,实验组HUVECs小管形成长度小于对照组,伤口愈合率低于对照组,差异均具有统计学意义。3、尾静脉给药后,实验组小鼠肺脏可见沉积的MWNCTs颗粒,并出现肺间隔增厚、肉芽肿形成,主动脉未见明显病理变化;血管新生实验中,实验组小鼠新生血管数量少于对照组,差异具有统计学意义。4、蛋白芯片结果显示,实验组HUVECs细胞功能相关蛋白表达量减少;ELISA结果表明,实验组HUVECs上清液中VEGF水平低于对照组,实验组小鼠血清中VEGF水平低于对照组,差异均具有统计学意义;Western-Blot结果显示,实验组AKT、eNOS水平表达量低于对照组,差异具有统计学意义。5、加入重组VEGF后,实验组HUVECs小管形成长度、小鼠新生血管数量和AKT、eNOS表达水平增加,差异均具有统计学意义。结论通过上述实验,得到结论如下:1、MWCNTs能够损伤HUVECs,降低HUVECs的小管形成能力和伤口愈合能力,减弱小鼠的血管新生能力,提示MWCNTs能够导致血管内皮功能障碍。2、MWCNTs能够下调HUVECs VEGF的表达量和小鼠血清VEGF水平,并下调下游AKT、eNOS的表达量;加入重组VEGF后,由MWCNTs造成的功能损伤作用被逆转,AKT、eNOS的表达量增加。提示MWCNTs致血管内皮功能障碍是通过抑制VEGF/AKT/eNOS实现的3、两种直径MWCNTs均可造成相似的血管内皮功能损伤,提示所考察的MWCNTs中,直径因素未对血管内皮毒性产生显著影响。