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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type,PCV2)引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated diseases,PCVDs),PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显著升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框(ORFs),其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5(signal transducer and activator of transcription5,STAT5)是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin 1,NPM1)是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6(heat shock protein40 B6,DNAJB6)属于热休克蛋白40(Hsp40)家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高(96.3%)。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高(98.2%)。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高(90.9%)。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异(p>0.05),而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显著高于对照组(p<0.05)。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显著低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数(p<0.05)。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序(5’TTCTCTGAA3’),该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆(PCV2-MDS)不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链(负链)的探针(RFP)和靶向病毒基因组模板链(正链)的探针(CP)阳性细胞数量都显著降低(p<0.05);荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显著低于野生型PCV2感染细胞(p<0.05)。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显著下降(p<0.05)。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显著下降(p<0.05)。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株(PCV2-Nm A)感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显著下降(p<0.05)。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显著降低(p<0.05)。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显著增加(p<0.05),48 h进一步增加(p<0.01),DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显著降低(p<0.05)。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显著降低(p<0.01)。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15(PKV)发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显著增加(p<0.05),并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显著升高(p<0.05)。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显著降低(p<0.01)。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显著降低(p<0.01),且病毒DNA拷贝数显著下降(p<0.01)。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显著下降(p<0.01)。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显著降低(p<0.01)。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显著降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显著低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显著降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。