背景希佩尔林道(Von Hippel-Lindau,VHL)基因是应用位置克隆技术从VHL病家族成员中克隆的一种肿瘤抑制基因,由于VHL基因突变引起的VHL病是一种家族性常染色体显性遗传性肿瘤综合征。VHL基因通过其编码的蛋白质(VHL protein, pVHL)发挥多种生理功能,参与调节细胞周期、细胞分化及凋亡；通过控制血管形成调节胎盘血管发生,并且参与胚胎发育。VHL基因在人体的器官组织中广泛表达,介导多个器官系统的生理功能,其突变及表达异常引起中枢神经系统、肾脏、肾上腺、胰腺及附睾等器官系统的病变。生殖细胞VHL基因突变是VHL病的发病基础。体细胞VHL基因突变及表达异常参与多种非遗传性肿瘤的发生,与乳腺癌、卵巢肿瘤和宫颈癌等女性常见恶性肿瘤的发生、发展有密切联系。子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,输卵管妊娠是类似肿瘤细胞的滋养细胞植入输卵管的病理性生殖事件,国内外尚未见VHL基因突变及表达异常与子宫内膜癌、输卵管妊娠关系的研究报道。深入研究VHL基因在子宫内膜癌及妊娠输卵管组织中的表达及突变情况,分析其异常表达及突变与子宫内膜癌和输卵管妊娠两种女性生殖系统常见疾病的关系,从基因水平上探讨疾病发生的可能机制,为疾病的临床诊断提供理论依据,并且开辟一条基因治疗疾病的新途径。目的1.以育龄期妇女输卵管和发生输卵管妊娠的输卵管组织标本为研究对象,检测VHL基因在正常输卵管和妊娠输卵管组织中的表达及变化,探讨VHL基因表达变化与输卵管妊娠发生的关系。2.应用自动化测序仪,检测妊娠输卵管组织VHL基因3个外显子PCR扩增产物纯化后的DNA序列,与正常输卵管组织相对应的基因序列比较,从基因水平上探讨输卵管妊娠发生的可能机制。3.以人正常子宫内膜、子宫内膜增生和子宫内膜腺癌组织标本为研究对象,检测VHL基因在正常、增生和腺癌子宫内膜组织中的表达,分析VHL基因表达的变化趋势,探讨VHL基因表达变化与子宫内膜恶变的关系。材料与方法1. VHL mRNA和蛋白在人妊娠输卵管组织中的表达20例未破裂型壶腹部妊娠输卵管组织标本,均包括种植部位(距离妊娠囊5mm以内的部位)和非种植部位(距离妊娠囊10mm以外的部位),分为种植部位组(n=20)和非种植部位组(n=20)。20例分泌期壶腹部输卵管组织标本,取自行输卵管结扎术或者因良性子宫疾病行全子宫加附件切除术的患者,既往月经规律、有正常生育史,作为正常对照组(n=20)。应用免疫组织化学法检测正常输卵管和妊娠输卵管组织石蜡标本中VHL蛋白的表达,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time RT-PCR)检测正常输卵管和妊娠输卵管新鲜组织标本中VHL mRNA水平,应用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测VHL蛋白的表达。2.妊娠输卵管组织中VHL基因DNA序列分析20例妊娠输卵管组织标本取自未破裂型壶腹部妊娠行输卵管切除的患者,既往月经规律,无宫腔内节育器及辅助生育技术干预史,自然受孕后盆腔超声提示附件区包块,无宫内妊娠迹象,孕龄为6-9周,手术前未接受甲氨蝶呤治疗,作为输卵管妊娠组(n=20)。10例分泌期壶腹部输卵管组织标本取自行输卵管结扎术或者因良性子宫疾病行全子宫加附件切除术的患者,既往月经规律、有正常生育史,术前半年未接受外源性激素治疗及化疗,作为正常对照组(n=10)。妊娠输卵管组织VHL基因外显子1、2、3的PCR扩增产物纯化后,应用自动化测序仪进行DNA序列测定,与正常对照组相对应的基因序列进行比较。3. VHL mRNA和蛋白在人正常子宫内膜和子宫内膜增生组织中的表达60例正常子宫内膜组织石蜡标本,按组织学分期分为增生期(n=30)和分泌期(n=30)；90例子宫内膜增生组织石蜡标本,按增生程度分为简单型增生(n=30)、复杂型增生(n=30)和不典型增生(n=30)。子宫内膜新鲜组织标本包括正常子宫内膜(n-40),子宫内膜简单型增生(n=26)、复杂型增生(n=23)和不典型增生(n=20)。标本取自因良性子宫疾病行诊断性刮宫术或者全子宫切除术的患者。应用免疫组织化学法检测子宫内膜石蜡标本中VHL蛋白的表达,应用Real-time RT-PCR和Western blotting技术检测子宫内膜新鲜组织标本中VHL mRNA和蛋白的表达。4. VHL mRNA和蛋白在人子宫内膜腺癌组织中的表达子宫内膜腺癌组织标本包括石蜡标本(n=30)和新鲜标本(n=17),取自因子宫内膜腺癌行全子宫切除术的患者。应用免疫组织化学法检测子宫内膜腺癌组织石蜡标本中VHL蛋白的表达,应用Real-time RT-PCR和Western blotting技术检测子宫内膜腺癌新鲜组织标本中VHL mRNA和蛋白的表达。5.统计学分析计量资料数据以均数±标准差((?)±s)表示,组间比较应用单因素方差分析,应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。免疫组化数据以阳性单位(positive unit, PU)值表示,Real-time RT-PCR数据应用比较Ct值法(2-△△Ct法)进行相对定量分析,Western blotting数据应用目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度比值表示目的蛋白相对量,DNA序列应用Bioedit软件进行分析。检验标准取双侧[=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义结果1. VHL mRNA和蛋白在人妊娠输卵管组织中的表达免疫组织化学法检测VHL蛋白表达于人输卵管粘膜上皮纤毛细胞和分泌细胞的胞浆,其中纤毛细胞的纤毛亦有表达,间质细胞表达微弱。VHL蛋白在妊娠输卵管种植部位组表达水平强(1.53±0.98),在妊娠输卵管非种植部位组(1.29±0.79)和正常对照组(1.21±0.67)表达水平弱。种植部位组与非种植部位组及正常对照组VHL蛋白表达水平比较均有显著性差异(P<0.01),非种植部位组与正常对照组VHL蛋白表达水平比较无统计学差异(P>0.05)。VHL mRNA表达水平在妊娠输卵管种植部位组(2.79+0.74)高于非种植部位组(2.11+0.52)和正常对照组(2.08+0.69)(P<0.01),妊娠输卵管种植部位组VHL蛋白表达高于非种植部位组和正常对照组(P<0.05),非种植部位组与对照组VHL mRNA和蛋白表达水平比较无统计学差异(P>0.05)。2.妊娠输卵管组织中VHL基因DNA序列分析组织标本提取DNA后PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳均可见清晰的特异性扩增条带,VHL基因外显子1、2、3扩增片段长度分别为409bp、208bp、271bp。PCR扩增产物经纯化后,应用自动化测序仪进行DNA序列测定。测序结果显示,输卵管妊娠组VHL基因外显子1、2、3扩增片段基因序列与正常对照组相对应的基因序列相同,未发现突变。3. VHL mRNA和蛋白在人正常子宫内膜和子宫内膜增生组织中的表达免疫组织化学法检测VHL蛋白表达于人子宫内膜腺上皮细胞的胞浆和间质,表层子宫内膜腺上皮细胞表达水平比基底层细胞强。VHL蛋白在增生期和简单型增生子宫内膜中表达水平强,在分泌期、复杂型增生及不典型增生子宫内膜中表达水平弱。VHL蛋白表达水平在增生期(5.66+1.77)与分泌期子宫内膜(4.86±1.63)比较有显著性差异(P<0.01),与简单型增生子宫内膜(5.56+1.76)比较无统计学差异(P0.05)。VHL蛋白表达水平在简单型增生、复杂型增生(4.74+1.82)及不典型增生子宫内膜(2.61±1.18)逐渐减弱,并且有显著性差异(P<0.01)。VHL mRNA在正常(2.65+0.56)和简单型增生(2.43+0.37)子宫内膜中呈现高表达,在复杂型增生(1.80+0.26)及不典型增生(1.21±0.12)子宫内膜中表达水平降低。VHL mRNA在正常子宫内膜和简单型增生子宫内膜之间表达水平比较无统计学差异(P>0.05),在子宫内膜增生组织中从简单型增生、复杂型增生到不典型增生表达水平依次降低(P<0.01)。VHL蛋白在正常、简单型增生及复杂型增生子宫内膜中呈现高表达,显著高于不典型增生(P<0.01)。4. VHL mRNA和蛋白在人子宫内膜腺癌组织中的表达免疫组织化学法检测子宫内膜腺癌腺上皮细胞中仅有VHL蛋白微弱的表达(2.53+1.27),VHL蛋白表达水平显著低于增生期、分泌期、简单型增生及复杂型增生子宫内膜(P<0.01),与不典型增生子宫内膜表达水平比较无统计学差异(P>0.05)。VHL mRNA和蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达水平略低于不典型增生子宫内膜(P>0.05),显著低于正常子宫内膜、简单型增生子宫内膜及复杂型增生子宫内膜(P<0.01)。结论1. VHL mRNA和蛋白在人正常输卵管和发生输卵管妊娠的输卵管组织中均有表达,在妊娠输卵管种植部位表达水平高于非种植部位及正常输卵管。VHL基因在妊娠输卵管种植部位高表达,调控输卵管局部血管内皮生长因子及纤维结合蛋白的表达,有利于胚胎发育、粘附及植入,发生输卵管妊娠。2.正常输卵管和妊娠输卵管组织VHL基因外显子1、2、3,PCR扩增后均能获得与设计引物长度相同的特异性扩增条带。妊娠输卵管组织VHL基因3个外显子扩增片段基因序列与正常输卵管相对应的基因序列相同,未发现突变。3.人正常子宫内膜和子宫内膜增生组织中均存在VHL mRNA和蛋白,VHL基因在正常子宫内膜中表达水平高,增生期高于分泌期；VHL基因在子宫内膜增生组织中的表达趋势为简单型增生、复杂型增生到不典型增生依次降低。VHL基因能够降调节血管内皮生长因子,增生期子宫内膜及简单型增生子宫内膜中VHL基因表达水平高,提示高水平的VHL基因降低子宫内膜中血管内皮生长因子的表达,抑制血管过度增生。4. VHL mRNA和蛋白在人子宫内膜腺癌组织中呈现低水平表达,并且与不典型增生子宫内膜表达水平无差异,提示VHL基因异常低表达参与从子宫内膜不典型增生进展到子宫内膜腺癌的恶变过程,VHL基因表达水平可以作为子宫内膜腺癌的早期预测指标。