[研究目的]随着人口老龄化、免疫受损人群增加及介入性医疗操作的增多,侵袭性真菌病发病率不断升高,并且疾病预后不佳,已成为临床面临的重大威胁。同时,抗真菌药物耐药性的发生与增长,给患者的治疗带来了更大挑战。深入了解重要病原真菌的遗传进化特征与种群结构,有助于阐明特定物种应对自然选择与环境压力下出现的遗传变异,并发现具有耐药性表型等适应性优势特征的种群是否存在传播与扩张。为此,本研究针对我国引起侵袭性真菌病的重要念珠菌物种开展了遗传进化研究,并揭示了相关物种种群特征与抗真菌药物耐药之间的相关性。[研究方法]研究依托中国医院侵袭性真菌监测网（China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net,CHIF-NET）工作的积累,本研究主要分为四大部分。第一部分,针对中国念珠菌血症病原体的流行病学与药物敏感性监测数据更新。研究纳入了 2014年8月至2017年7月的3年间,由全国77家医疗机构所收集的非重复菌株。使用MALDI-TOFMS结合DNA测序进行菌种鉴定,并使用YeastOne显色微量肉汤稀释法测定菌株药物敏感性。在此基础上,对菌种的分布与耐药性进行了统计分析。第二部分,开展了针对我国克柔念珠菌的遗传进化特征研究。课题建立并评价了一套新型微卫星分型体系用于克柔念珠菌的分子分型。使用该方法,研究对我国来自10个城市15家医院的48株克柔念珠菌开展了种群特征研究,并在此基础上分析了该物种自身遗传背景与感染患者特点以及菌株抗真菌药物敏感性之间的潜在关联。第三部分,开展了针对我国白念珠菌的群体基因组学研究。课题共纳入了 33个城市中收集的370株引起侵袭性真菌病的白念珠菌株进行全基因组测序,并引入了181株白念珠菌国际菌株基因组进行比较分析。研究主要挖掘了白念珠菌系统发育特征、特别是特定遗传种群与抗真菌药物非敏感表型间的关系,同时预测了导致药物耐药的分子机制。第四部分,开展了针对我国热带念珠菌的群体基因组学分析。研究共纳入了我国27个城市的398株热带念珠菌,以及78株国际菌株全基因组数据。课题对所有菌株进行了基于全基因组的系统发育分析以及染色体的多倍性及非整倍性分析。进一步探究了种群分支与重要抗真菌药物耐药性的关联,并分析了主要耐药种群的分子特征机制。[研究结果]第一部分:在收集的4,010株引起念珠菌血症的分离株中,尽管白念珠菌仍然是最常见的物种,但非白念珠菌的比例已达2/3以上。大多数白念珠菌和近平滑念珠菌对所有抗真菌药物保持敏感（耐药率＜5%）。然而监测三年期间,光滑念珠菌对伏立康唑的敏感性出现持续下降（非野生型表型从＜20%上升到约50%）。此外,热带念珠菌的氟康唑耐药率从2009-2010年的＜10%已经增长到2016-2017年的＞30%。此外,在罕见念珠菌物种中,超过1/3的角膜念珠菌对氟康唑和5-氟胞嘧啶交叉耐药,而＞56%的希木龙念珠菌具有多药耐药表型。第二部分:课题通过对克柔念珠菌的基因组分析建立了一套微卫星分型体系,其中包含33个微卫星位点。该方法的累积分辨率可达1.000。利用微卫星分型方法进行的系统发育分析显示,我国的克柔念珠菌分为两个种群Cluster A（n=17）和ClusterB（n=31）,而主坐标分析也支持这一结论。ClusterA菌株感染的病人主要是小于10岁的儿童或大于50岁的老年人;而Cluster B感染患者涵盖了所有年龄组。Cluster B菌株显示出更高的遗传多样性,对6种抗真菌药物MIC范围更宽、并出现了各类药物最高的MIC值。第三部分:研究结果显示,66.6%的唑类不敏感白念珠菌属于既往报道的种群Clade 1。通过系统发育建树、杂合性缺失事件和种群结构分析,研究进一步发现Clade 1中的特定分支具有更显著的唑类敏感性降低。其中,Clade 1-R（n=44）的唑类不敏感率达到了 44%,而Clade 1-R-α（Clade 1-R的亚群,n=9）的所有分离株均对四种唑类药物高度耐药。Clade 1-R-α菌株在Erg11p中出现了独有的A114S和Y257H双氨基酸替换,同时调节Cdr药物外排泵的转录因子Tac1中存在A736V替换,在世界范围内,Clade 1-R-α菌株仅在我国发现,但具有广泛的地域跨度。第四部分:对476个热带念珠菌基因组的分析,共发现14个主要的系统进化分支,不同分支的国际国内菌株占比有所差异。95%以上的菌株为二倍体,但也发现了少量单倍体、三倍体及八倍体菌株（n=13）,以及不同染色体的非整倍性及拷贝数变异现象;另外菌株中出现杂合性缺失事件较频繁。纳入的我国105株氟康唑耐药热带念珠菌,75%属于高度保守的CNR种群。所有83株CNR菌株全部分离自我国,98%为唑类非敏感,全部携带Erg11p的Y132F和S154F双替换,另外主要亚支同时携带Tac1的A446E与E507D变异。该种群广泛分布于我国各地。[研究结论]在我国引起侵袭性真菌病的病原念珠菌中,由天然耐药及获得性耐药导致的抗真菌药物敏感性下降问题已经较为突出。通过遗传进化分析,我们在包括白念株菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等代表性物种中都发现了一些特定的种群与抗菌药物耐药表型高度相关,并在国内广泛的地域范围内出现泛传播与扩张。因此,我们在传统的流行病学与药物敏感性监测的基础上,需进一步重视相关耐药克隆群的播散与增长,并对其扩张优势背后的分子机制开展进一步的研究。