不定根发生是无性系林业生产中的关键问题,核桃是重要的经济林树种又是难以诱发不定根的树种。所以,以核桃为试材从理论上探讨不定根发生机制具有重要理论与实践意义。 本文首先以不同木本植物为试材,对蛋白质组学研究的关键技术-双向电泳的某些重要技术环节进行探讨,对其过程中蛋白质的样品制备、等电聚焦、平衡、凝胶染色等,等几个重要环节进行优化。通过比较研究得出丙酮沉降提取蛋白法,较适合于木本植物的叶、茎等蛋白质含量较低的器官;木本植物的种子等部位的蛋白质适合于用三氯乙酸制干粉法提取;Colloidal考马斯亮兰方法是一种较灵敏的蛋白质染色方法;建立了一套适合于木本植物的2-DE+MALDI-TOF-MS技术平台。采用优化的双向电泳方法,我们对核桃成熟子叶不定根发生过程中的相关蛋白质进行了鉴定,发现在不定根分化期(诱导5d)有44个蛋白质上调节表达,45个蛋白质下调节表达,108个蛋白质基本不变。进一步对上调节表达的33个蛋白质进行分析,其中18个蛋白质出现在根原基分化(诱导3d)之前。对发生变化的蛋白质进一步研究发现:下调节表达蛋白酸性蛋白居多,上调节表达蛋白碱性蛋白居多;下调节表达蛋白大分子量蛋白分布较多,下调节表达蛋白小分子量蛋白分布相对较多。最后我们选择了7个上调节表达蛋白质(L1、L2、L3、L8、L9、L43、L44)进行肽质谱指纹分析并进行同源性比较,发现L1是与过氧化氢酶相近的蛋白质;L2是与查尔酮合成酶相近的蛋白质;L3与硝酸盐转运蛋白质相近;L8、L9、L43、L44是新蛋白质,在已有的数据库中未能找到相近的蛋白质。进一步选择L1进行MS/MS分析确定为过氧化氢酶。 本文根据木本植物的特点建立了一套与其相对应的蛋白质组学研究方法,首次利用蛋白质组学技术对核桃子叶不定根发生期间表达的蛋白质进行了解析。今后的研究应在现有结果的基础上,进一步拓展核桃子叶生根过程中的蛋白质差异表达的研究,改进现有的技术和方法,采用特异的或高通量蛋白质展示技术,鉴定更多的生根相关的蛋白质。