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棉铃虫Helicoverpa armigera(H(?)bner)和甜菜夜蛾Spodoptera exigua(H(?)bner)都是寄主范围广泛的重要夜蛾科害虫。我国自1997年种植转基因抗虫棉花,Bt(Bacillus thuringiensis)棉花的种植不仅有效的控制了棉花上棉铃虫的种群,而且减轻了其他作物上棉铃虫的为害,但目前种植的表达Cry1Ac蛋白的抗虫棉对甜菜夜蛾的防治效果较差。转双价抗虫棉花(表达Cry1Ac+Cry2Ab蛋白)可以延缓棉铃虫等靶标害虫的抗性发展,还可以扩大杀虫谱,同时防治包括甜菜夜蛾在内的多种鳞翅目害虫,现已在多个国家广泛种植。人们认为Cry2A与Cry1A类蛋白存在不同的杀虫机制,但关于Cry2A类蛋白的作用机制还研究较少。本文首先比较了棉铃虫中肠不同受体蛋白(钙粘蛋白、氨肽酶N、碱性磷酸酯酶)与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力,克隆了甜菜夜蛾的中肠碱性磷酸酯酶2(ALP2)的基因,证实了甜菜夜蛾中肠ALP2是Cry1Ac的一种结合蛋白后,进一步比较了棉铃虫、甜菜夜蛾的ALP2与Cry1Ac、Cry2Aa结合能力的差异。研究结果可为进一步明确Cry2A蛋白的作用机制、合理种植应用双价抗虫棉等提供依据。结果如下:1.利用ELISA动力学方法,比较了Cry1Ac和Cry2Aa毒素与棉铃虫中肠受体的结合能力。研究结果发现:活化的Cry1Ac、Cry2Aa杀虫蛋白都能与原核表达的钙念蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)、碱性磷酸酶(ALP)受体结合。其与Cry1Ac杀虫蛋白的结合能力分别是:0.2519nM,245.nM,121.7nM;与Cry2Aa杀虫蛋白的结合能力分别是:0.836nM,9.813nM,47.91nM。2.为明确甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶是Cry1Ac杀虫蛋白的受体,利用同源克隆和RACE技术,克隆编码甜菜夜蛾中肠alp2完整的cDNA序列,结果表明该序列全长1 629 bp(已经在GenBank中登记,序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含一个21个氨基酸的信号肽,在C端存在一个GPI修饰的锚定位点,以及在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。3.利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,结果表明ALP2在每个龄期均有表达,但是1龄幼虫ALP2表达量最低,4龄最高。利用Ligand blot方法检测了甜菜夜蛾中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合,结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。4.利用ELISA实验测定了棉铃虫、甜菜夜蛾中肠受体ALP与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力。结果表明无论是在棉铃虫中还是在甜菜夜蛾中,ALP与Cry2Aa的结合能力都要远高于Cry1Ac;其次,我们的结果还发现Cry1Ac与棉铃虫的结合是特异性结合而与甜菜夜蛾的结合是非特异性结合,Cry2Aa与棉铃虫的结合能力要远远高于甜菜夜蛾,因此这些结合能力的不同可能导致了这两种毒素对不同昆虫毒力的不同。