免疫系统一般分为先天免疫和后天免疫,大多数的生物都主要依靠先天免疫机制生存。先天免疫系统是生物体内形成的一种防御机制,通过模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）识别微生物的分子结构,对入侵病原做出快速反应,保护宿主免受侵害。在正常的生理条件下,非活性形式的NF-κB二聚体通过与IKB抑制蛋白（IκBα、IκBβ和IκBε）相互作用被封存到细胞质中;在细菌感染后,Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）被激活并介导NF-κB信号通路。随着NF-κB活化并进入细胞核内,诱导先天免疫的下游细胞因子和趋化因子的合成,以发挥其抗菌活性和维持系统稳态的作用。先天免疫对细菌的清除,构成了细菌的选择性进化压力,促使细菌获得逃避免疫攻击的能力。自噬被认为是宿主对抗细菌入侵的策略之一,能协助机体清除病原菌,在真核生物抵抗细菌入侵中发挥重要作用。通常情况下,细胞能通过自噬清除入侵的胞外细菌以及胞质中的定植细菌,但一些细菌能够―劫持‖自噬,促进自身生长和繁殖。随着进化的进展,几乎所有的先天免疫系统,如传统的PRRs和炎症小体,都能与自噬结合在一起,被称为免疫自噬。目前关于免疫自噬的研究还处于起步阶段,仍有许多有趣的谜题和重要问题亟待解决。本研究通过对自噬参与NF-κB信号通路调控的研究,旨在探寻自噬在细菌入侵时,自噬对先天性免疫的调控机制,并为自噬在鱼类-细菌相互作用中的作用提供了新的见解。1.e IF3k靶向My D88自噬降解抑制NF-κB信号通路NF-κB信号通路的激活对于启动炎症反应和消除入侵的细菌至关重要,而细菌也同样进化出了逃避免疫的能力。细菌主要通过干扰细胞内信号通路和破坏宿主的免疫反应逃避免疫,然而细菌扰乱宿主NF-κB信号的机制尚不清楚。本研究首先通过label-free蛋白质组学测序技术对髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,My D88）的Co-IP产物进行定性分析,筛选出负调控My D88的真核翻译启动因子3k（eukaryotic translation initiation factor 3 subunit k,e IF3k）。作为真核翻译启动因子e IF3家族的成员,e IF3k除了行使该家族启动翻译的功能外,还能抑制NF-κB信号通路。双荧光素酶报告实验和RT-q PCR实验结果表明,e IF3k有效抑制了哈维氏弧菌（Vibro harveyi,V.harveyi）感染触发的炎症因子（IL-6,IL-8,TNFa）的表达和NF-κB的报告基因活性。此外,本研究确定了e IF3k通过自噬途径介导My D88降解,V.harveyi感染诱导自噬关键基因5（Autophagy Related 5,ATG5）高表达,并且ATG5与e IF3k形成复合物诱导自噬形成。从机制上讲,V.harveyi诱导的e IF3k表达增强了E3泛素连接酶Nrdp1介导的My D88的K27位泛素化,并充当连接被泛素化后My D88和ATG5的桥梁,最终形成ub-My D88-e IF3k-ATG5复合物被运送到自噬小体中与溶酶体融合后进行降解,终止My D88介导的NF-κB信号。本研究确定了e IF3k是My D88依赖性NF-κB途径的特异性抑制剂,并表明e IF3k可能作为选择性自噬受体,与ATG5协同促进My D88的自噬降解,从而帮助V.harveyi逃避先天免疫。2.ackr4a诱导自噬抑制NF-κB信号通路并阻断凋亡信号促进V.harveyi感染宿主能以多种方式清除入侵的病原菌,其中自噬和凋亡是两种研究较为透彻的抗细菌机制。然而,在与宿主共同进化的过程中,细菌也获得了逃避免疫、利用宿主防御机制实现自我复制的能力。在本研究中,通过转录组测序,筛选出在V.harveyi感染前后的差异基因,并从中筛选出可能参与先天免疫的非典型趋化因子受体4（atypical chemokine receptor 4,ackr4）家族成员ackr4a。双荧光素酶报告实验和实时定量PCR实验结果表明,ackr4a有效地抑制了V.harveyi感染触发的NF-κB信号通路及下游炎症因子（IL-1β和TNFa）的表达和报告基因活性。ackr4a诱导上调自噬关键基因Beclin-1并以ackr4a-Beclin-1复合物的形式靶向My D88自噬降解,且V.harveyi感染增强了ackr4a与Beclin-1的结合。同时还发现,ackr4a能有效的阻断细胞凋亡,促进V.harveyi感染。在凋亡早期,ackr4a诱导的自噬增强,下调凋亡关键基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶7/8（cysteinyl aspartate specific proteinase 7,Caspase7和cysteinyl aspartate specific proteinase 8,Caspase8）。此外,ackr4a作为转录因子Ap-1（activator protein 1,Ap-1）的转录靶点,在V.harveyi感染时,上调的Ap-1促进ackr4a转录,并诱导自噬形成。在机制上,V.harveyi诱导的Ap-1激活ackr4a转录和表达。一方面,ackr4a分别与Beclin-1和My D88形成复合物,诱导自噬并将My D88运输到溶酶体中降解,以抑制NF-κB信号通路。另一方面,ackr4a诱导的自噬抑制Caspase8阻断细胞凋亡信号。本研究首次阐明了V.harveyi同时利用自噬和凋亡来逃避先天免疫,表明V.harveyi已经进化出一种新的能力来对抗鱼类的免疫系统。