副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是重要的食源性致病菌,广泛存在于海产品中,如果消费者误食用未经加工或加工不彻底的海产品,可能会出现肠胃不适、腹泻、呕吐等症状。目前全球气候变暖引起的海洋因子的变化以及各种恶劣气候现象的出现,促使海洋中各种致病细菌不断进化并完善自己的一套生存系统,并发展出各种抵御外界恶劣环境的方式以获得更大的存活可能,同时入侵和攻击宿主。而外界环境中无论是自然环境还是海产品运输加工过程中,其中对海洋性微生物非常重要的影响因子有温度、酸。本文针对低pH酸对副溶血性弧菌的胁迫所获得的酸耐受性菌株,以此为材料从生物学特性、运动性、生物膜形成能力、耐药性和细胞毒性各个指标,结合转录组及蛋白组数据来分析比较出发菌株和酸耐受株之间的差异,分析和探讨副溶血性弧菌生物学特性和抗逆耐受机制,为水产品储藏、运输和加工过程可能带来的微生物危害提供参考,为副溶血性弧菌风险评估提供基础数据和理论依据。本论文主要研究内容及结果如下:1.酸耐受菌株的获得。将保存于-80°C甘油管的副溶血性弧菌经过两次活化一次纯化后扩大培养至对数中后期(OD600=0.6)的菌液作为工作菌液。将工作菌液在一系列酸值的培养基中进行处理2h,通过经典的倍比稀释平板涂布法计算各个酸值培养基条件下副溶血性弧菌的存活数,将存活数低于105CFU/mL的酸值条件选定为challenge pH(达到使人体感到不适的细菌数量),结果表明,在酸值pH=4的TSB 3%NaCl中处理2h后细菌存活数低于105个CFU/mL,即pH=4为challenge pH。后在challenge pH条件下进行酸耐受定向培养,直至其在challenge pH条件下细胞存活数高于105CFU/mL后,即为获得酸耐受菌株。2.出发菌株与酸耐受菌株生物学特性、运动性、生物膜形成能力、耐药性及细胞毒性的差异比较。本章节通过比较出发菌株与酸耐受菌株其生物学特性、运动性、生物膜形成能力、耐药性及细胞毒性的变化,来初步了解酸耐受菌株在酸胁迫条件下表现的适应机制。通过肉眼观察菌落形态,扫描电镜观察菌体个体形态和大小。结果发现酸耐受株菌落形态较出发菌株出现由中心向外周辐射的褶皱,且边缘不光滑整齐,通过显微镜观察发现菌落中出现空斑,而非均质分布;通过扫描电镜观察两株菌株外部形态,发现均呈短杆状,形态大小无明显差异。细胞能动性实验,即采用经灭菌竹签将单一菌落接种至能动平板上,37℃孵育20-24h,观察细菌从接种点迁移形成的浑浊区域的大小,拍照记录实验结果(观察并测量细菌从接种点迁移形成的浑浊区域的直径大小),结果表明酸耐受菌株在泳动性能上较出发菌株出现显著性提高,而在蹭行性和集群性运动方面则无明显差异。通过传统结晶紫染色方法检测出发菌株和酸耐受菌株生物膜形成能力的变化,通过在最大成膜时间点(72h)所形成生物膜量的差异来反应成膜能力,结果发现酸耐受菌株较出发菌株在72h时所形成的生物膜量显著减少,即生物膜形成能力明显降低。根据clsi标准(美国临床实验室标准化组织)将出发菌株与酸耐受菌株对18种药物进行药敏试验,结果发现出发菌株对青霉素类的氨苄有耐药性,对氨基糖苷类的链霉素、卡那霉素,头孢类的头孢唑啉以及青霉素类的哌拉西啉四种药物处于耐药中介水平,对其它药物均为敏感。而酸耐受菌株则对氨苄以及上述物种药物均出现敏感,说明酸耐受菌株其耐药性能下降。通过细胞毒实验来比较毒性变化。将caco-2细胞与细菌以数量比为1:100的比例进行细胞侵染4h,通过两种染料分别染色活细胞和死细胞,利用默克流式细胞仪分别进行活细胞和死细胞计数,来检测活细胞存活数率。结果发现,出发菌株对细胞侵染4h后,活细胞数量在11%左右,而相比之下,由酸耐受菌株对细胞侵染4h后,细胞存活数量在60%左右,存活数量明显提高,说明酸耐受菌株对细胞的侵染及毒性降低。3.出发菌株与酸耐受株转录组学分析、内参筛选及转录组数据验证。利用illuminahiseqtm2500高通量测序技术平台对临床分离的o3:k6血清型副溶血性弧菌大流行株及其酸耐受菌株高通量测序得到的转录文库进行比对分析,出发菌株和酸耐受菌株文库分别获得了1.61g和1.69g数据量。对测序数据进行过滤、拼接和组装后共获得4603个转录本,其中4447个转录本注释为己知功能蛋白。|log2(foldchange)|>2且qvalue<0.001(极显著差异)为筛选阈值,在出发菌株和酸耐受菌株中共获得871个显著差异表达的基因。相对于出发菌株,酸耐受菌株中有414个差异基因为上调表达,457个为下调表达。生物学功能和信号通路富集分析表明,差异表达基因主要富集到代谢途径、次生代谢产物的生物合成、不同环境微生物代谢及氨基酸生物合成等相关信号通路中。极显著差异表达基因中,与膜蛋白有关的基因33个,与鞭毛有关的基因21个,与耐药基因有关的基因6个,与毒性相关的基因22个,与转录调控相关的基因51个,与金属代谢和热应激相关的基因分别有16个和4个。以已有研究常用到的内参基因(16srrna,reca,rpos,pvsa,pvua,andgapdh),针对副溶血性弧菌不同菌株(o3:k6-clinicalstrain-tdh+,atcc33846-tdh+,atcc33847-tdh+,atcc17802-trh+,andf13-environmentalstrain-tdh+),不同培养温度条件下,利用genorm,normfinder,bestkeeper,anddeltact等不同计算方法的软件对以上候选内参基因进行评价和排序,从而筛选得到适合具体实验条件的内参基因。所得出的结论为reca基因为本研究条件中即针对不同菌株,不同温度实验条件下最为稳定的内参基因,其次为pvsa和pvua基因。以reca基因连同16srrna一并作为内参基因,对随机选取的4个上调基因,4个下调基因和2个无差异表达基因进行定量pcr,结果发现,qrt-pcr结果与测序结果一致,说明转录组数据结果可信。4.副溶血性弧菌比较蛋白组学分析。通过labelfree非标记定量方法和对所得肽段进行拼接,将拼接好的蛋白序列进行库比对注释,然后将出发菌株o3:k6-c和酸耐受菌株o3:k6-e进行差异表达分析。经分析共获得差异表达蛋白共1231个,571个在两组样本中都表达,另外305个蛋白序列仅在o3:k6-c样本中检测到表达,355个仅在o3:k6-e样本中检测到表达。将得到的差异表达蛋白数据联合转录组数据一起分析,结果得到注释一致的序列共有546条。其中,转录组和蛋白组数据差异表达趋势一致的基因共203个。其中ats、dps和ompt三个差异表达蛋白为酸耐受菌株较出发菌株显著性高表达,这与其酸耐受机制有关。另外t3ss表达在酸耐受菌株中直接不表达,而其t2ss在酸耐受菌株中表达上调。从蛋白水平更好的解释了细胞毒性实验结果,以及MSHA菌毛相关蛋白表达下调,可能和生物膜形成能力下降和粘附性降低有关。