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目的:本实验以血管新生为切入点,选择AKT/eNOS信号转导路径为干预靶点探讨不同时间点电针联合丰富康复训练对血管新生的调控作用,为临床治疗缺血性脑卒中实验基础与理论依据,丰富临床治疗手段。方法:1.实验选取体质量280-320g健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠(SPF级)160只遵随机原则取27只为假手术组(Sham组),其余大鼠用于建立大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,得到成功模型108只,遵完全随机原则分为模型(Model)组、电针(EA)组、康复(RT)组和针康(EA+RT)组,每组根据3d、7d、14d三个时间点分为三个亚组,每个亚组9只,每组共27只。2.Sham组与Model组大鼠置于动物房常规饲养,不做其他治疗处理;EA组大鼠取“百会”、“风府”、“心俞”、“内关”(偏瘫侧取穴)四穴进行电针治疗,每天1次,每次20min;RT组进行丰富康复训练,包括声、光、抚触等感官刺激和康复训练,每天一次,持续14d;EA+RT组以电针和丰富康复训练共同干预。3.各组大鼠按longa5分制分别于造模后4h及治疗后3d、7d、14d四个时间点记录神经功能缺损评分;TTC染色检测脑梗死体积;苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织病理变化;Western blot检测缺血皮质区AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白的相对表达量;RT-qPCR检测AKT/eNOS mRNA相对表达量;Weidner法计数缺血半暗带微血管密度(Microvessel Density,MVD)。结果:1.大鼠神经功能缺损评分(NDS)Sham组大鼠术后各时间点均无神经功能缺损体征,NDS均为0分,与Sham组相比,Model组术后4h、3d、7d、14d NDS均明显上升(P<0.01);术后4h、3d,EA组神经功能缺损评分与Model组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与Model组相比,EA、RT、RA+RT组术后干预4h、3d时差异无统计学意义,干预7d、14d时NDS显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05);EA+RT组与EA、RT组相比,术后4h时NDS无明显差异,术后3d、7d时NDS虽有下降趋势但差异不具有统计学意义,术后14d时NDS显著降低(P<0.01),提示术后随时间延长治疗效果逐渐累积,至14d时出现明显差异。组内不同时间点相比:EA组7d与3d相比NDS明显下降(P<0.05),神经功能缺损体征改善,14d与7d相比无显著性差异;RT组7d与3d相比NDS明显下降(P<0.05),14d与7d相比无显著性差异;EA+RT组7d与3d相比NDS明显下降(P<0.05),神经功能缺损体征改善,14d与7d相比无显著性差异。2.脑组织病理学观察(HE染色)Sham组大鼠缺血侧皮质区细胞结构完整,细胞质均匀分布,细胞核呈紫色并且形状规则,细胞呈正常形态,术后3d、7d、14d之间未见明显变化;Model组大鼠缺血侧皮质区可见大量皱缩的细胞聚集,排列紊乱,细胞核变形溶解甚至消失,细胞结构紊乱无序,细胞质呈蓝紫色且不均匀,随着时间累积病理性改变逐渐减弱;EA组、RT组、EA+RT组大鼠缺血皮质区术后三个时间点较Model组病变程度均较轻,细胞结构相对完整,染色更为均匀,细胞排列更有序,并且EA+RT组相比EA组、RT组改善程度更为明显。3.脑梗死体积测算(TTC染色)经TTC染色,脑组织缺血区域显现苍白色,正常组织呈红色,两者之间界限明显。结果显示,Sham组术后三个时间点(3d、7d、14d)梗死灶体积为0,与Sham相比,术后干预3d、7d、14d Model组、EA组、RT组和EA+RT组梗死灶体积均明显增大,差异具有显著性(P<0.01),提示模型复制成功;EA组与Model组相比,干预3d、7d、14d时梗死体积均显著缩小(P<0.01),RT组与Model组相比,干预3、7、14d时梗死体积均显著缩小(P<0.01);EA+RT组与EA组比较,治疗3d、7d、14d时梗死灶显著缩小(P<0.01或P<0.05),EA+RT组与RT组相比,干预各时间点(3、7、14d)梗死体积均显著缩小(P<0.01);EA组与RT组相比,治疗各时间点差异不具有统计学意义(P>0.05)。4.Western检测AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白的相对表达量Sham组大鼠缺血皮质区AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白正常表达,与Sham组相比,Model组治疗3、7、14d缺血侧AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白含量均显著增加(P<0.01);与Model组相比,EA组、RT组、EA+RT组缺血侧AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白含量在治疗3、7、14d均明显上升(P<0.01);与EA组相比,EA+RT组干预3、7、14d缺血侧AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白含量均显著增加(P<0.01或P<0.05);与RT组相比,EA+RT组干预3、7、14d缺血侧AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白含量显著增加(P<0.01或P<0.05);EA组与RT组相比,各时间点均无明显差异。5.RT-qPCR检测AKT/eNOS mRNA相对表达量与Sham组相比,Model组大鼠术后三个时间点缺血侧皮质AKT/eNOS mRNA相对表达量均显著上升(P<0.01);与Model组相比,EA、RT、EA+RT组干预后3、7、14d缺血侧皮质区AKT/eNOS mRNA相对表达量均显著上升(P<0.01或P<0.05);与EA组相比,RT组AKT/eNOS mRNA相对表达量差异无统计学意义,EA+RT组AKT/eNOS mRNA相对表达量明显增多(P<0.01);与RT组相比,EA+RT组AKT/eNOS mRNA相对表达量亦明显增多且差异具有统计学意义(P<0.01)。6.缺血区血管新生观察与Sham组相比,Model组微血管密度(MVD)在术后3、7、14d均有少量增加(P<0.05或P<0.01);与Model组相比,EA、RT、EA+RT组MVD计数在术后3、7、14d均显著升高(P<0.01);与EA组比较,EA+RT组MVD在术后各时间点均明显增多(P<0.01);与RT组相比,EA+RT组在术后各时间点MVD数量均明显上升(P<0.01);EA组与RT组相比,各时间点均无明显差异。组内不同时间点相比:EA组7d与3d相比MVD明显增多(P<0.01),14d与7d相比MVD计数亦明显增多(P<0.05);RT组7d与3d相比MVD明显增多(P<0.01),14d与7d相比MVD计数亦明显增多(P<0.05);EA+RT组7d与3d相比MVD明显增多(P<0.01),14d与7d相比MVD计数亦明显增多(P<0.05)。结论:1.电针联合丰富康复训练可有效改善MCAO大鼠脑组织病理变化,改善细胞形态。2.造模后3d、7d、14d电针联合丰富康复训练均能够显著改善MCAO大鼠神经功能缺损体征,减少脑梗死体积,且联合疗法优于单一疗法。3.术后不同时间点电针联合丰富康复训练均能够有效调控MCAO大鼠缺血侧皮质区血管新生相关因子AKT/p-AKT/eNOS/p-eNOS蛋白及AKT/eNOS mRNA的表达,增加微血管密度,促进血管新生,且疗效优于单一疗法,推测其疗效高峰可能在术后7d到14d之间。