一、研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。糖链具有多种生物学功能,在细胞生长、分化、粘附过程中发挥着重要作用。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤。众所周知,在肿瘤细胞中,复杂糖链的结构发生了异常改变,并且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。发生这种变化的具体机制尚不清楚,但在大多数情况下,糖基转移酶的激活起着主要的作用,由此导致了所谓的肿瘤组织“异常糖基化”。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ（N-acetylglucosaminyltransferaseⅤ,GnT-Ⅴ）在N-糖蛋白的形成中有极其重要的作用,能催化形成N-糖链的β-1,6分支,β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在肿瘤组织含量丰富,特别是一些高转移潜能的肿瘤,与肿瘤的转移和恶性转化密切相关。在生物体中,RNA干扰（RNAi）是一种序列特异性的转录后基因沉默方法,它是由与目的基因序列同源的双链RNA（dsRNA）引起的。在RNAi反应中,长链dsRNA被细胞内的核糖核酸酶Ⅲ——Dicer裂解成大约21-25nt的小干扰RNA（siRNA）,这些siRNA与其他蛋白联合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）,导致同源目的基因的降解,从而导致目的基因的转录后抑制。目前关于GnT-Ⅴ表达与结直肠癌关系的相关研究较少,尚未见RNA干扰方面的研究,因此在本研究中,我们首次采用RNA干扰技术抑制GnT-Ⅴ的表达,构建了针对结直肠癌中高表达基因GnT-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人结直肠癌LoVo细胞,观察GnT-Ⅴ的表达变化对LoVo细胞体外及体内增殖及转移能力的影响,为结直肠癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。二、研究目的构建针对结直肠癌中高表达基因GnT-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人结直肠癌LoVo细胞,观察GnT-Ⅴ的表达变化对LoVo细胞体外及体内增殖及转移能力的影响,为结直肠癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。三、实验方法1、pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA质粒的构建及鉴定（1） GnT-ⅤsiRNA序列的设计:按照siRNA设计原则,利用Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”,根据NCBI数据库中GnT-Ⅴ基因（NM₀02410.3）cDNA,设计针对GnT-ⅤcDNA的RNA片段,序列分别如下:sense 5′GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3′,sense 5′CTCCTTTGACCCTAAGAAT 3′。分别命名为GnT-Ⅴ/1564和GnT-Ⅴ/2224。将其中一对的序列打乱排列,经Blast比对,无任何同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列如下:sense 5′GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3′,命名为GnT-Ⅴ/NC。（2） shRNA转录模板DNA的设计:根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（6个T）、BamHⅠ酶切位点。（3）质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ的构建及鉴定:先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。2、细胞培养及转染人结肠癌细胞株LoVo在37℃5%CO₂条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2～3次。LoVo细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000^TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000^TM将质粒导入LoVo细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。3、干扰效果检测（1） RT-PCR测定GnT-ⅤmRNA用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA。GnT-Ⅴ上游引物为5′AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC 3′,下游引物为5′TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3′。反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共36个循环,最后72℃再延伸10min。使用β-actin作为内参,上游引物为5′GAAACTACCTTCAACTCCATC 3′,下游引物为5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3′。GnT-Ⅴ扩增产物长度为555bp,β-actin长度为219bp。电泳后UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值,用GnT-Ⅴ/β-actin代表GnT-Ⅴ的相对表达量。（2） Western blot检测GnT-Ⅴ蛋白表达提取总蛋白,用测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上样buffer煮沸7min,离心后吸取30μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体（1:200）、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体（1:1000）4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG（1:500）、HRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000）,室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值,用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ的相对表达量。4、干扰后对LoVo细胞增殖、粘附及转移的影响（1） CCK-8检测细胞增殖性取各组对数生长期的待测细胞,CCK-8法分析不同时间点（0h、24h、48h、72h、96h）的细胞活力,每个时间点分别检测8个复孔。测量两组的OD450nm值,绘制生长曲线,并计算干扰组的生长抑制率。细胞生长抑制率（IR）=（对照组OD450值—干扰组OD450值）/对照组OD450值×100%。（2）异质粘附实验取各组对数生长期的待测细胞,每组设24个孔。细胞用无血清RPMI1640培养过夜。Matrigel胶50μL/孔铺96孔板,10g/L BSA煮沸13min变性后封闭,按5×10³/孔加入细胞悬液,37℃孵育1h。1×PBS冲洗3次,CCK-8法测量各组OD450nm值。（3）趋化运动实验取对数生长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室检测细胞迁移性,趋化因子为10%新生牛血清。结果表示为穿过聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数（400×）。（4）划痕愈合实验取对数生长期的待测细胞,细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板,培养至细胞呈现出单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕,用含10%FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0h、12h、24h、36 h每个孔取4个视野拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[（愈合前两侧细胞层距离-愈合后两侧细胞层距离）/愈合前两侧细胞层距离1×100%。（5）细胞侵袭实验取对数生长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性.结果表示为穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数（400×）。5、体内实验（1）裸鼠成瘤实验取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为2.5×10⁷/mL,按100μL/只进行臀部皮下注射。左臀部:阴性对照组,右臀部:干扰组。（2）脾脏保留法制备裸鼠肝转移模型10%水合氯醛100μL/只行腹腔内麻醉。取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×10⁷/mL,按50μL/只进行脾注射。术后继续在SPF条件下饲养。接种后3周处死裸鼠,打开腹腔,观察脾脏有无癌灶,观察肝脏有无转移,记录肝脏表面转移结节数量,所有转移瘤均经病理切片HE染色证实。6、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。两组比较采用t检验,多组比较采用方差分析,以P＜0.05表示有统计学意义。四、结果1、重组体的双酶切及测序鉴定将重组质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/1564、pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/2224、pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ/NC用BbsⅠ和BamHⅠ双酶切,酶切产物进行电泳检测,发现重组体中已成功插入目的片段。测序鉴定结果与设计序列完全相符,所含目的基因序列准确无误。结果表明GnT-ⅤshRNA及阴性对照shRNA成功构建于pGPU6/GFP/Neo载体上,重组质粒构建成功。2、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,说明稳定转染成功。3、干扰效果检测各组细胞均能扩增出555bp的GnT-Ⅴ基因片段,条带强弱不一致。LoVo GnT-Ⅴ/1564和LoVo GnT-Ⅴ/2224组细胞GnT-Ⅴ基因的表达较LoVo GnT-Ⅴ/NC组明显降低,表明转染GnT-ⅤshRNA载体能抑制目的基因mRNA表达,Western blot结果也显示转染GnT-ⅤshRNA载体能抑制GnT-Ⅴ蛋白表达。Image-Pro Plus 6.0软件分析GnT-Ⅴ基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示LoVoGnT-Ⅴ/1564、LoVo GnT-Ⅴ/2224组mRNA水平的抑制率分别为82%和71.5%,蛋白水平的抑制率分别为68%和56%,与LoVo GnT-Ⅴ/NC组相比均有统计学意义（P＜0.001）。选择干扰效率较高的LoVo GnT-Ⅴ/1564进行下一步实验。4、GnT-ⅤshRNA对细胞增殖的影响以细胞在不同时间点（0h、24h、48h、72h、96h）的OD450nm值绘制细胞生长曲线,并计算出LoVo GnT-Ⅴ/1564的生长抑制率,可见GnT-ⅤshRNA对LoVo细胞增殖呈明显的抑制作用,尤以72h为著,与对照组相比均有统计学意义（P＜0.001）。5、GnT-ⅤshRNA对细胞粘附性、运动性和侵袭性的影响以Matrigel胶模仿基底膜进行粘附实验,结果显示下调GnT-Ⅴ表达可增强LoVo细胞的粘附能力（t=-3.357,P＜0.01）,而显著抑制LoVo细胞的趋化运动性（t=44.051,P＜0.001）,划痕实验也显示抑制GnT-Ⅴ表达显著延长LoVo细胞的愈合时间。用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验结果显示,LoVo GnT-Ⅴ/1564、LoVo GnT-Ⅴ/NC的穿膜细胞数分别为（5.10±1.25）个和（39.55±2.16）个,LoVo GnT-Ⅴ/1564组的穿膜细胞数较阴性对照组明显减少（t=61.626,P＜0.001）。6、GnT-ⅤshRNA对裸鼠皮下成瘤实验的影响LoVo GnT-Ⅴ/NC组与LoVo GnT-Ⅴ/1564组瘤体的平均重量分别为（1.20±0.05）g和（0.48±0.04）g,统计结果表明LoVo GnT-Ⅴ/1564组细胞形成瘤体重量明显低于LoVo GnT-Ⅴ/NC组（t=27.528,P＜0.001）。7、GnT-ⅤshRNA对LoVo细胞裸鼠肝转移能力的影响LoVo GnT-Ⅴ/NC组与LoVo GnT-Ⅴ/1564组的平均肝脏转移结节数分别为156.67±55.61个和24.83±56.11个,虽然下调GnT-Ⅴ表达未能阻止转移发生,但是LoVo GnT-Ⅴ/1564组肝脏表面结节数明显低于LoVo GnT-Ⅴ/NC组（t=38.923,P＜0.001）。五、结论1、靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表达质粒可以显著下调GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表达。2、下调GnT-Ⅴ的表达后,LoVo细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。3、下调GnT-Ⅴ的表达可以抑制LoVo细胞的体内增殖及肝转移能力。4、该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗结直肠癌的有效靶点。