目的:烟曲霉是临床上最常见的机会性致病真菌之一,可在免疫功能低下的患者中引起致命的侵袭性曲霉病。糖尿病已成为曲霉菌感染的危险因素之一。糖尿病患者中侵袭性肺曲霉病的发生率甚至比免疫功能低下的患者更高。在高血糖状态下,感染会引起细胞因子的水平升高,而后者又会引起胰岛素抵抗,进而导致恶性循环,并加剧感染的严重程度。在烟曲霉感染部位通常会形成缺氧的微环境。作为缺氧环境的核心因素,转录因子缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)被激活并在抗真菌免疫和炎症反应中发挥重要作用。已有研究表明,在高血糖状态下,HIF-1α被抑制且能引发功能障碍。因此,HIF-1α的抑制作用可能是导致感染恶化的重要因素。但是机制仍不清楚。已有证据表明,HIF-1α在调节免疫和炎症中发挥着重要作用,其能够有效的帮助宿主防御感染。然而,HIF-1α信号转导在糖尿病患者合并肺烟曲霉菌感染中的作用仍是未知的。本研究课题旨在通过临床病例回顾性研究以及建立糖尿病合并肺烟曲霉菌感染小鼠模型来探究其感染特征并探讨HIF-1α在糖尿病合并肺烟曲霉菌感染中发挥作用的内在机制,进而为糖尿病患者合并肺烟曲霉菌感染的治疗提供新的理论依据。方法:1.探究糖尿病合并肺烟曲霉菌感染的感染特点以及HIF-1α的表达情况在本实验部分中,首先我们对中国医科大学附属第一医院2008年3月至2018年7月的真菌性肺炎患者进行临床回顾性研究,分析合并糖尿病对患者病程的影响。在动物模型方面,我们选取SPF级健康成年C57/bl6雄性小鼠,随机分为正常对照组(nondiabetic组,n=30)、正常感染组(nondiabetic,A.f组,n=30)、糖尿病对照组(diabetic组,n=30)、糖尿病感染组(diabetic,A.f组,n=30)。参考既往文献,通过单次大剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型。利用气管插管技术经气管对小鼠接种50微升烟曲霉孢子悬浊液或无菌PBS。在插管后的第1,2,3,4,7,14天分别处死各组小鼠。通过存活率、肺组织匀浆菌落计数、肺部烟曲霉孢子免疫荧光染色以及血清烟曲霉抗原ELISA检测来评估感染情况。通过肺组织病理切片HE染色观察白细胞浸润情况、血清细胞因子检测来评估炎症反应。通过肺组织免疫印迹技术检测HIF-1α表达情况。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺烟曲霉菌感染中的作用及可能机制探讨在本实验部分中,我们选取SPF级健康成年C57/bl6雄性小鼠,随机分为正常组(nondiabetic组,n=30)、糖尿病组(diabetic,vehicle组,n=30)、糖尿病给药组(diabetic,DMOG组,n=30)。参考既往文献,通过单次大剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型。利用气管插管技术经气管对所有小鼠接种50微升烟曲霉孢子悬浊液。给药组通过腹腔注射二甲基草酰甘氨酸(DMOG)激活HIF-1α。在插管后的第1,2,3,4,7,14天分别处死各组小鼠。通过存活率、肺组织匀浆菌落计数、肺部烟曲霉孢子免疫荧光染色以及血清烟曲霉抗原ELISA检测来评估感染情况。通过肺组织病理切片HE染色观察白细胞浸润情况、血清细胞因子检测来评估炎症反应。通过肺组织免疫印迹技术检测HIF-1α表达情况。通过肺组织转录组测序探讨HIF-1α可能的作用机制。(18)(13)高糖在缺氧环境下对烟曲霉孢子诱导人THP-1巨噬细胞HIF-1α激活的影响及其下游信号通路的初步研究在本实验部分中,我们将人THP-1细胞诱导分化成的巨噬细胞分为5.5mM糖浓度组、30mM糖浓度组、30mM+DMOG组、30mM+DMOG+Alum组,通过在细胞培养液中加入HIF-1α的激动剂DMOG、NLRP3炎症小体的激动剂氢氧化铝(Alum)分别调节HIF-1α与NLRP3炎症小体的表达。在低氧条件下与烟曲霉孢子进行共培养,分别在0,12,24小时收集巨噬细胞及细胞培养上清。通过巨噬细胞免疫印迹检测HIF-1α、NLRP3表达情况。通过ELISA法检测细胞上清中IL-1β的分泌情况。加入幼稚T细胞与烟曲霉孢子刺激过的巨噬细胞共培养48小时,通过流式细胞技术检测核内、胞内以及表面因子,评估辅助T细胞(Th细胞)以及调节性T细胞(Treg细胞)的分化比例。结果:1.探究糖尿病合并肺烟曲霉菌感染的感染特点以及HIF-1α的表达情况1.1临床回顾性研究发现,在真菌性肺炎患者中,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者住院时间更长。免疫系统损伤以及糖尿病均可作为延长真菌性肺炎患者住院时间的独立危险因素。(P<0.05)1.2与其他组相比,糖尿病感染组小鼠的死亡率显著升高,小鼠死亡主要集中在感染后的前三天。(P<0.05)1.3与正常感染组相比,糖尿病感染组小鼠的孢子清除减慢,至感染后的第14天,肺部匀浆菌落计数、肺部病理烟曲霉抗原免疫荧光检测仍呈阳性。血清中的烟曲霉抗原表达量也高于正常感染组。(P<0.05)1.4与正常感染组相比,糖尿病感染组小鼠的炎症反应更加严重。感染后,糖尿病感染组小鼠肺部呈弥漫性炎症细胞浸润且消退延迟。血清中炎症因子的释放普遍升高,在感染后的第2、3天达峰。(P<0.05)1.5感染后,正常感染组小鼠肺部HIF-1α被激活(P<0.05),而糖尿病感染组小鼠HIF-1α表达情况与糖尿病对照组无明显差别。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺烟曲霉菌感染中的作用及可能机制探讨2.1DMOG能够激活糖尿病合并肺烟曲霉菌感染小鼠肺组织中的HIF-1α。(P<0.05)2.2应用DMOG后,糖尿病感染小鼠的死亡率降低,烟曲霉孢子清除加快,至感染后的第14天,肺部匀浆菌落计数、肺部病理烟曲霉抗原免疫荧光检测已转为阴性。血清中的烟曲霉抗原表达量的峰值也随之降低。(P<0.05)2.3应用DMOG后,糖尿病感染小鼠的炎症反应有所缓解。肺部炎症细胞浸润程度减轻且能按时消退。感染后第2天,血清中的炎症因子释放量较用药前普遍减少。(P<0.05)2.4肺部转录组检测显示,与正常感染组相比,糖尿病感染组小鼠与炎症反应相关的基因表达明显增多,多条炎症相关通路被激活,而DMOG的应用可通过激活HIF-1α纠正炎症反应的过度激活。(P<0.05)3.高糖在缺氧环境下对烟曲霉孢子诱导人THP-1巨噬细胞HIF-1α激活的影响及其下游信号通路的初步研究3.1高糖培养条件下,巨噬细胞在缺氧条件下接受烟曲霉孢子刺激后,HIF-1α未被及时激活,NLRP3炎症小体过度激活,其下游IL-1β的分泌也随之增加。(P<0.05)3.2应用DMOG后,可在高糖条件下激活HIF-1α,并纠正NLRP3的过度激活以及IL-1β的过度分泌(P<0.05)。而NLRP3炎症小体的激动剂Alum仅能提高NLRP3以及IL-1β的表达,对HIF-1α的表达不产生影响。3.3高糖培养条件下,烟曲霉孢子刺激后的巨噬细胞在缺氧条件下会诱导T细胞向Th2以及Th17方向分化,而Th1以及Treg的分化比例减少(P<0.05)。DMOG能够纠正这种T细胞分化比例的失衡(P<0.05),而Alum的应用则会减弱DMOG的调节作用。结论:1.糖尿病会加重肺部烟曲霉感染。主要表现为死亡率高、孢子清除慢、炎症反应重。2.糖尿病合并肺部烟曲霉感染时,HIF-1α的表达被抑制。(18)(13)通过过表达HIF-1α可以缓解糖尿病合并肺烟曲霉的感染病情,降低死亡率、加快孢子清除、抑制过激的炎症反应。4.高糖低氧环境下,HIF-1α可能通过调控NLRP3炎症小体的激活来调节T细胞的分化,进而发挥其抗烟曲霉感染的保护作用。