关节腔注射是将药物直接输送至类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者炎症部位的一种局部治疗手段,当前多以溶液剂剂型为主,注射后在关节腔内迅速消除难以达到持续的治疗作用,往往需多次重复给药。所以现阶段局部注射用温敏凝胶制剂作为关节腔注射缓控释剂型,已逐渐被广泛研究,该剂型通过具有温敏性能的高分子共聚物材料作为载体,注射后在关节腔内发生相变成半固体状,以达到增加药物在关节腔滞留时间的目的,可有效提高关节腔内的局部药物浓度,并降低口服药物产生的胃肠道等全身毒副作用,减少患者注射次数,提高病人的顺应性及治疗效果。当前已有学者采用左旋聚乳酸[1](PLLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[2](PLGA)为载体制备关节腔注射用甲氨蝶呤缓释微球,但微球制剂往往存在突释现象,且注射初期会产生急性炎症反应。马桂蕾等[3]利用聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)作为载体材料制备甲氨蝶呤温敏凝胶并对其进行体内药代动力学研究,注射后24h甲氨蝶呤的血药浓度仍高于检测限。然而,该剂型采用乙腈作为溶剂,需严格控制其溶剂残留量在安全值内。本课题选用具有增溶作用的两亲性嵌段共聚物聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯(PLGA-PEG-PLGA)为载体,甘露醇为黏度调节剂采用物理混合法制备可供关节腔注射的甲氨蝶呤温度敏感型凝胶,并以胶凝温度为指标,并选取对胶凝温度影响较大的PLGA-PEG-PLGA、甲氨蝶呤、甘露醇用量作为考察因素,以正交试验优化筛选出甲氨蝶呤温敏凝胶的优化处方,当PLGA-PEG-PLGA浓度为25%,甲氨蝶呤0.20%,甘露醇0.10%;PLGA-PEG-PLGA25%,甲氨蝶呤0.20%,甘露醇0.10%时,凝胶温度为35℃。并对PLGA-PEG-PLGA共聚物进行结构表征。建立了甲氨蝶呤温敏凝胶的质量控制方法,采用高效液相色谱法测定甲氨蝶呤温敏凝胶药物含量,对3批自制的甲氨蝶呤温敏凝胶进行了考察,结果表明该法专属性强、精密度高,3批样品中的平均载药率均达到90%以上。考察温敏凝胶的流变学特性,研究其相变过程中的流变学变化。采用透析袋法考察凝胶聚合物浓度及载药量对甲氨蝶呤温敏凝胶体外释药情况的影响,并研究其体外释药机制。结果表明,plga-peg-plga浓度为25%的甲氨蝶呤温敏凝胶在体外缓释效果最佳,可持续释放药物12d以上,释放率可达90.58%。将释放度与时间分别对于不同释放模型进行拟合,发现ritger-peppas模型的r值最大,推测其释放过程是以药物扩散与凝胶溶蚀相结合的方式。由于该制剂具有温敏性能,本研究采用60co辐射灭菌法灭菌,对灭菌前后温敏凝胶的外观形态、温敏性能、药物含量及体外释放行为进行考察。结果表明,辐射灭菌对该制剂无明显影响。通过影响因素试验及长期稳定性试验,结果表明,该制剂在高温、光照下不稳定,应在低温下、避光保存。于大鼠皮下囊内注射含青霉素钠的羧甲基纤维素钠和脂多糖溶液建立大鼠皮下气囊炎症模型,造模成功后分别注射生理盐水、甲氨蝶呤溶液及甲氨蝶呤温敏凝胶,并于给药后第3、6、9天采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠渗出液中肿瘤坏死因子水平,同时取皮下囊皮肤制组织切片观察其在大鼠体内的持续治疗效果。结果显示,甲氨蝶呤溶液组给药后第3d、6d、9d的肿瘤坏死因子水平与生理盐水组相比分别下调了27.31%±4.37%、42.70%±3.92%、52.28%±4.00%;而甲氨蝶呤凝胶组给药后第3d、6d、9d的肿瘤坏死因子水平与生理盐水组相比分别下调了24.28%±3.05%、52.45%±3.22%、68.96%±2.85%。组织切片显微照片结果显示,甲氨蝶呤溶液组和甲氨蝶呤凝胶组相对生理盐水组炎症均有改善,而甲氨蝶呤凝胶组在给药后9d时炎性细胞仍保持在较低水平,与溶液组具有显著性差异,长期治疗效果优于甲氨蝶呤溶液。取SD大鼠,皮下注射空气造模后,分别于每组大鼠皮下囊内注入生理盐水和甲氨蝶呤温敏凝胶。于注射药物后第1、3、7d分别并取大鼠背部囊处皮肤,考察温敏凝胶的生物相容性情况。结果表明给药后无明显炎症细胞,7d后两组间未见显著性差异。分别在KM小鼠皮下囊处注射混有近红外染料新吲哚菁绿的甲氨蝶呤溶液和甲氨蝶呤凝胶后,定时观察皮下囊处的荧光残留强度,采用小动物活体成像仪考察温敏凝胶的局部滞留性。结果显示,甲氨蝶呤溶液组在注射后1d已基本消除,而甲氨蝶呤凝胶组在9d时的滞留量为17.11%,可显著增加药物在体内的滞留时间。综上所述,本研究制备的甲氨蝶呤温敏凝胶符合注射剂的一般质量要求,,注射入关节腔后可迅速发生相变,并可在局部长期滞留,对于慢性炎症有较好的长效治疗作用。在类风湿性关节炎的长期用药中,相比于普通溶液剂具有明显优势和应用前景,可减少给药次数、避免关节感染并减轻药物毒副作用。