结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,是全球第四大最常见的恶性肿瘤。近年来,随着人民生活水平的不断提高,饮食习惯和饮食结构的改变及人口老龄化,我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势,并且年龄明显提前。在全世界,每年大约有70万人因结直肠癌死亡。在早期阶段,单纯手术可能治愈,但是由于结直肠癌的早期症状比较模糊,患者往往在确诊时已经发生了转移,错过了治疗的最佳时机。大约25％的患者初次就诊时就已经发生转移,50％新诊断的患者将死于结直肠癌转移。结直肠癌发生的确切原因还未知,其发生与遗传和环境因素都有关系。随着分子生物学技术的发展,逐步认识到结直肠癌的发生是一个多步骤、多阶段、多基因参与的疾病。转移是影响患者治疗效果和死亡的重要原因,因此探讨结直肠癌发生、发展及转移的相关因素,寻找预防和治疗的有效途径,是当前一项迫切的任务。　　 RGC32是重要的补体应答基因,最早是由Badea在鼠的少突胶质细胞中克隆出来；RGC32基因定位于13q14.11,全长1126个bp,编码137个氨基酸,有5个外显子和4个内含子。RGC32在胎盘、骨骼肌,肾脏、胰腺、肝脏及大动脉内皮细胞等正常组织细胞中表达,而在心脏、脑组织低表达、肺组织细胞未见表达。补体的激活、C5b-9、类固醇激素、生长因子、免疫血清均可以诱导RGC32mRNA的表达。研究发现RGC32可能在细胞周期调控、补体介导的炎症反应、肿瘤转移、组织细胞分化、肾小管间质纤维化过程中起着非常重要的作用。RGC32在多种肿瘤中表达异常,RGC32在皮肤T细胞淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤组织中高表达,其中在结直肠癌组织中RGC32的表达上调更为显著。Fosbrink等报道70％的结直肠癌组织中RGC32蛋白表达显著高于正常粘膜,并且Sonia I.Vlaicu等发现RGC32的表达量与结直肠癌的TNM分期呈相关的趋势。RGC32在一些肿瘤转移灶中表达也明显升高:Kang等发现在骨转移的乳腺癌组织中RGC32高表达,Kakiuchi等发现在肺小细胞癌微小的转移灶中RGC32在中高表达。　　 RGC32在肿瘤中所起的作用还不明确,其作用机制的研究也比较少,其在结直肠癌发生、发展及转移中的作用及机制也尚未阐明。本研究重点探讨RGC32基因在结直肠癌中的表达及在结直肠癌发生、发展及转移中的作用及机制,为结直肠癌的诊断治疗及预后提供新的思路。　　 第一部分:RGC32在人结直肠癌细胞系和结直肠癌组织中的表达　　 运用RT-PCR和Western blot方法在基因和蛋白水平检测RGC32在6种结直肠癌细胞株中的表达；应用免疫组化S-P法,检测60例结直肠癌组织中RGC32蛋白的表达情况。　　 RT-PCR和Western blot检测了6种结直肠癌细胞株中RGC32的表达,结果表明,RT-PCR和Western blot检测的结果比较一致。6株细胞中RGC32均有表达,在结肠癌淋巴结转移癌建系的SW620中表达最强,在由南方医科大学病理科自建的具有高选择肝脏转移特性的SW480亚系SW480/M5细胞株中表达也较高,在结肠癌原发癌建系的SW480、HCT116、HT29和LS174T细胞株中为中低度表达,RGC32在转移性较高的结直肠癌细胞中表达明显高于无转移性或低转移性大肠癌细胞。　　 免疫组化检测RGC32蛋白在结直肠癌组织中的表达,结果表明:RGC32蛋白表达的阳性信号定位于细胞浆内,在正常结直肠粘膜组织内,基本上是阴性表达,在高、中、低分化的结直肠癌组织里,均有表达,RGC32在癌组织中的表达高于正常组织。RGC32表达的高低与病人的性别、年龄、肿瘤的分化程度的差别没有显著性(P>0.05),但是RGC32表达的高低与肿瘤有无转移的差别具有显著性(x2=6.065,P=0.014),RGC32蛋白表达与结直肠癌的转移高度相关,即RGC32表达越高,结直肠癌发生转移的几率就越高。同时我们观察发现RGC32在痛周围侵袭性生长的梭形变的痛细胞中显著高表达。RGC32在转移性较高的结直肠癌细胞及组织中表达明显高于无转移性或低转移性结直肠癌细胞和组织,RGC32表达水平与结直肠癌转移呈正相关。　　 第二部分:RGC32的表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响　　 构建RGC32真核表达载体,运用RT-PCR扩增目的基因RGC32的全长,与空载质粒PCDNA3.0连接后,转染SW480细胞；设计RGC32的干扰片段,合成SiRNA,转染SW620细胞。RT-PCR和Western blot鉴定转染后RGC32在SW480和SW620细胞中的表达,采用平板克隆实验及流式细胞仪检测细胞周期观察过表达及干扰前后细胞增殖能力的变化,transwell小室实验以观察细胞侵袭能力的变化,同时用划痕实验,观察过细胞迁移能力的变化。　　 RT-PCR和Western blot检测表明,转染重组质粒PCDNA3.0-RGC32后,在基因水平及蛋白水平RGC32的表达量均明显增多；转染RGC32 SiRNA后的SW620细胞在基因水平及蛋白水平RGC32的表达量均明显减少,RGC32 SiRNA的干扰效率比较高。　　 平板克隆实验观察细胞的增殖能力,结果显示,SW480/Control细胞和SW480/RGC32细胞均能在平板中形成克隆,克隆形成率分别为72.667％和82.667％,采用两样本t检验分析发现,两组细胞的克隆形成能力不具有显著性差异(t=-0.702；P=0.521)。SW620/Control细胞和SW620/SiRGC32细胞均能在平板中形成克隆,克降形成率分别为88.333％和86％,采用两样本f检验分析发现,两组细胞的克隆形成能力不具有显著性差异(t=0.416；P=0.699)。说明RGC32表达变化,并未对结直肠癌细胞生长增殖能力产生显著性影响。　　 流式细胞术分析各细胞周期,SW480/Control和SW480/RGC32两种细胞的细胞增殖率分别为47.78％和51.753％,RGC32过表达组SW480/RGC32与对照组SW480/Control相比,细胞的增殖率没有显著性差异(t=-0.631；P=0.562)。SW620/Control和SW620/SiRGC32两种细胞的细胞增殖率分别为65.91％和67.79％,RGC32干扰组SW620/SiRGC32与对照组SW620/Control相比,细胞的增殖率没有显著性差异(t=1.144；P=0.316)。说明RGC32基因的表达变化未影响结直肠癌细胞的增殖速度。　　 通过transwell小室实验观察细胞的侵袭能力,过表达RGC32后的SW480/RGC32细胞穿过人工基底膜的细胞数量比SW480/Control穿过人工基底膜的细胞数量增多,SW480/RGC32侵袭能力明显增强,(t=-5.703,P<0.001)。干扰RGC32后的SW620/SiRGC32细胞穿过人工基底膜的细胞数量比SW620/Control穿过人工基底膜的细胞数量减少,差异具有统计学意义(t=4.204,P<0.001),干扰RGC32后的SW620细胞侵袭能力明显减弱。　　 采用划痕实验检测细胞迁移能力的变化,结果显示,划痕96h后,过表达组细胞SW480/RGC32划痕的愈合率高于对照组细胞SW480/Control划痕愈合率,过表达组细胞SW480/RGC32的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(t=-2.828；P=-0.047)。划痕96h后,干扰组细胞SW620/SiRGC32划痕愈合率低于对照组细胞SW620/Control划痕愈合率,干扰组细胞SW620/SiRGC32的迁移能力明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.317；P=0.029)。　　 通过过表达和干扰RGC32的表达分析结直肠癌细胞生物学行为的改变,结果显示,RGC32表达未显著性影响细胞的增殖；但是RGC32过表达后可以促进细胞的侵袭及迁移能力,RGC32干扰后可以抑制细胞的侵袭及迁移能力,提示RGC32的表达与细胞的侵袭及迁移能力成正相关。　　 第三部分:RGC32介导结直肠癌转移机制的初步探讨　　 利用Western blot分析过表达及干扰前后结直肠癌细胞的EMT主要标志物E-Cadherin和α-SMA表达的变化,进一步用。TGF-6刺激过表达及干扰前后结直肠癌细胞,分析EMT标志物表达的变化。结果发现,过表达RGC32后,SW480/RGC32组E-Cadherin及α-SMA的表达均无显著性改变。通过TGF-β刺激12h和24h后,SW480/RGC32组和SW480/Control组E-Cadherin的表达均降低,α-SMA表达均增高,但与SW480/Control组相比,SW480/RGC32组E-Cadherin的表达降低更显著(t=3.694,P=0.021；t=2.934,P=0.043),α-SMA的表达升高也更显著(t=-3.027,P=0.039:r=-3.358,P=-0.028)。而干扰RGC32后,SW620/SiRGC32组E-Cadherin及α-SMA的表达均无显著性改变。通过TGF-β刺激12h和24h后,SW620/SiRGC32组和SW620/Control组E—Cadherin的表达均降低,α-SMA表达均增高,但SW620/SiRGC32组和SW620/Control组相比,SW620/Control组E-Cadherin的表达降低更显著(t=-3.438,P=0.026；t=-5.372,P=0.006),α-SMA的表达升高也更显著(t=9.645,P<0.001；t=11.032,P<0.001)。TGF-β刺激后,RGC32高表达的结直肠癌细胞比较容易发生EMT,RGC32低表达的结直肠癌细胞不容易发生EMT,表明RGC32的表达与EMT的发生存在着正相关。提示,RGC32不能够单独诱导EMT,但在TGF-β介导的EMT通路中,RGC32影响TGF-β介导的EMT过程,RGC32可能是EMT通路中一个重要调节因子,RGC32通过参与调节EMT来促进结直肠癌转移。