转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花耐盐性分析盐渍化是全世界普遍存在土壤问题,很大程度上限制农作物产量。大约全球6%土地受到盐渍化影响并且有扩大的趋势。棉花是全球最重要的自然纤维与主要产油作物来源。在中国目前棉产区主要向西北内陆、濒海盐碱地聚集。提高棉花耐盐性对于推广其在盐碱地中的大量种植及解决“粮棉蔬争地”问题,有着重要的意义。甘氨酸甜菜碱(GB)作为一类的渗透保护物,可以有效地保护作物应对多种非生物胁迫。来自大肠杆菌的betA基因编码的胆碱脱氢酶能够促进胆碱合成GB。从盐芥克隆得到的TsVP基因负责编码H+-Ppase,其定位于植物液泡膜上,能为Na+在液泡中区隔化提供动力进而维持离子平衡。植物液泡膜上存在负责将胞质中Na+逆浓度梯度运输到液泡内的Na+/H+逆向转运蛋白是由NHX1所编码,过表达拟南芥中AtNHX1基因能显著增强植物耐逆性。本实验通过将三个负责两种不同代谢途径的基因共转化到棉花中,以达到获得耐盐性显著提高的棉花新种质的目的。将AtNHX1-betA-TsVP基因利用农杆菌介导法导入棉花中。选取大田盐碱地中农艺学性状表现较佳的三个株系(ABT1、ABT2、ABT3)等T3代植株作为实验材料,以转TsVP基因的T83株系(T6代)、转betA基因(T6代)的B29株系和鲁棉研21号(WT)作为对照,从基因表达水平、盐胁迫下的种子出苗、苗期与蕾期生理生化指标测定、盐碱地农艺学性状考察等诸多角度考察棉花的耐盐性的差异。对转AtNHX1-betA-TsVP基因植株的AtNHX1、betA TsVP基因进行了 PCR检测并利用q-PCR检测了基因的表达水平,结果表明AtNHX1-betA-tSVP基因成功转入棉花中并正常表达。沙培条件下各株系棉花在四叶期开始进行盐处理,分别取250 mM NaC1处理后第0、1、7、14、21天的植株材料测定各项生理状况。研究发现,盐胁迫前各株系棉花在叶绿素含量、植株干重、相对水含量(RWC)、饱和渗透式、Na+、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、FV/Fm、可溶性糖、离子渗漏、丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等指标上无显著差异。盐胁迫处理后,相对于WT和转betA、TsVP基因棉花,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具备显著更高叶绿素含量、植株干重、RWC、Na+、Pn、Gs、Fv/Fm、可溶性糖、SOD酶活和显著更低的饱和渗透式、离子渗漏、MDA。表明沙培条件下四叶期到蕾期转AtNHX1-betA-TsVP棉花的耐盐性最佳。水培条件下各株系棉花在四叶期开始进行0 mM、150 mM、250 mM NaCl胁迫,分别取不同浓度NaCl处理后第0、18天的植株材料测定多项生理指标。研究发现,盐胁迫处理前各棉花株系在RWC、饱和渗透式、干重、Pn、Fv/Fm等生理指标上不存在显著差异;盐胁迫处理后,相比于WT和转betA、TsVP基因棉花,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具有显著更高的RWC、干重、Pn、Fv/Fm和显著更低的饱和渗透式。表明水培条件下转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花的耐盐能力最佳。盐胁迫下种子出苗实验测定了棉花的出苗率、植株株高和干重。结果表明,在0 mM NaCl处理下各株系棉花的出苗率和干重无显著差异;在200 mM NaCl条件下转基因棉花的出苗率、株高和干重显著高于WT,转AtNHX1-betA-TsVP棉花比转betA/TsVP基因棉花具备更高出苗率和植株干重。因此,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花在种子出苗期比转TsVP/betA基因棉花和WT具有更强耐盐能力。东营盐碱地大田条件下,我们对不同棉花株系的大田籽棉产量等农艺学性状、Pn和Fv/Fm进行了测量与分析。数据分析结果表明,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花植株相比于其它株系棉花具有更高Pn、Fv/Fm、籽棉产量和更好的大田农艺学表现。实验结果说明将AtNHX1-betA-TsVP基因转化到棉花中可以很大程度上增强棉花耐盐能力。转GhPEAMT-betA基因棉花植株的获得GhPEAMT基因负责编码磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶,能够催化磷酸乙醇胺经过三步甲基化生成磷酸胆碱,是胆碱生物合成关键酶。betA基因负责编码胆碱脱氢酶能够催化胆碱生成甜菜碱醛,其是甜菜碱合成关键酶。将GhPEAMT-betA转化到棉花中有可能增强棉花细胞中甜菜碱的水平,有望增强棉花抗逆能力。本实验将GhPEAMT、betA基因构建到植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其转化到棉花细胞中,通过草甘膦初步筛选、PCR鉴定,获得转GhPEAMT-betA基因棉花。