周围神经损伤的修复一直是医学界感到十分棘手的问题，虽然采用了精细的显微外科技术，较好地恢复了损伤神经的连续性，但神经再生缓慢，而失感觉或运动神经支配的持续时间过长将导致肌肉和运动终板萎缩，使神经功能的恢复远不能令人满意。周围神经损伤修复后如何促进再生，提高神经损伤后的治疗效果，一直是基础和临床研究的热点。很多研究证实，周围神经断裂伤后，能否成功地再生，主要取决于是否具有适合离断神经生长再连接的微环境条件和中枢神经元的活力。 神经营养因子(neurotrophicfactor，NTFs)是神经元靶器官和雪旺细胞等分泌的一些蛋白质或多肽分子，具有一定的神经元群特异性，与特异性受体结合，被轴突末端摄取，经轴浆流逆向送到神经元胞体发挥维持神经元存活、促进神经生长的作用。目前研究表明，周围神经损伤修复再生需要多种NTFs，尽管损伤部位雪旺细胞(Schwann’s cells，SCs)可自身分泌一些NIFs，但是存在时间及浓度有限，往往不能满足神经再生的需要。因此，应用外源性NTFs促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一。 脑源性神经营养因子(brain derived neurotrphic factor,BDNF)对周围和中枢神经元具有广谱作用。对多种神经元有促进存活、增进代谢、有助分化与再生的功能。在外周神经系统，BDNF既可促进神经嵴和基板来源的感觉神经元的存活，又对运动神经元有营养作用，是一种极有希望的治疗因子，目前国外已进入临床试验阶段。但全身用药会产生一些副作用，局部应用也存在需要反复多次注射的缺点。如何既能使神经损伤部位的细胞在神经修复时不断合成及分泌BDNF，维持其有效作用浓度；又能避免给药途径上的不便?随着基因工程技术的迅速进步，基因治疗将有可能成为解决这一问题的 腺病毒介导的BDNF基因转移治疗大鼠坐骨神经损伤主要手段之一。 目前转基因技术用于治疗中枢神经损伤的研究报道越来越多，但有关周围神经损伤基因治疗的报道却相对少见。为数不多的一些报道，虽然采用以病毒为载体的体内直接基因治疗（in vivo）途经进行研究，但目的基因大多为LacZ等报告基因，而选择SCs为靶细胞，将NTFs基因转入SCs，使其分泌NTFs，促进周围神经损伤后神经再生的报道，则更为少见。为达到利用基因转染技术，通过载体的介导，将NTFs基因转入SCs，使其不断合成及分泌NTFs，从而保护神经元，促进周围神经再生，为周围神经损伤的治疗探索新途径。本实验选择携带BDNF cDNA表达片段的重组腺病毒 （AxCABDNF），采取神经内显微注射的方式，进行该载体的直接转基因治疗。通过原位杂交、免疫组化染色观察重组腺病毒直接转染Css后基因表达情况；借助对脊髓前角运动神经元和新生神经纤维进行计数，对新生神经髓鞘厚度进行测量，并在电镜下对AxCA－BDNF转染后的坐骨神经和相应脊髓进行超微结构观察等方法，从组织形态学上评价了大鼠坐骨神经损伤处理后脊髓前角运动神经元存活和神经再生情况；应用辣根过氧化物酶（horseradish eroxidese，HRP）逆行示踪技术，显示了神经联接再形成的效果；利用足印分析技术和电生理检查，判定了实验大鼠后肢神经功能的恢复情况。 所得主要结果和结论如下： 1．应用人胚肾293细胞作为包装细胞，成功的扩增了重组腺病毒载体AxCABDNF，并用改良的纯化技术进行了纯化，获得了50gi纯化病毒液，可完全满足实验需要；病毒空斑实验证实其具有很强的生物活性，转染效价达至2．2X108～1．SXdeo的高水平。 2．建立了坐骨神经断端直接注射转染，尔后硅胶管套接坐骨神经缺损的周围神经损伤转基因治疗的动物模型。并利用该模型进行了周围神经损伤后转基因治疗的实验研究。 3．原位杂交和免疫组化定量检测证实直接转染于坐骨神经后，断端的BDNF在该神经的雪旺细胞中得到表达，并经轴浆逆行转运，显著提高了相 Vlll 第三军医大学博士学位论文 应脊髓节段（L3－L6）神经元BDNInRNA和蛋白的表达水平。但1个月后表 达水平明显下降，此系腺病毒载体表达时限特点所致，并非基因转移的失败 4．光电镜病理组织学检查和图像分析证实，BDNF基因转染后，脊髓前 角运动神经元存活的数量、新生神经纤维数目及其髓鞘厚度均明显优于对照 组，HRP逆行示踪也证实神经联接的再形成优于对照组。说明应用腺病毒 介导的BDNF基因转移，不仅能促进损伤神经纤维再生，也能保护损伤的，脊髓神经元。 5．神经传导速度、肌肉复合动作电位和坐骨神经功能指数测定表明 BDNF基因转染损伤的坐骨神经后，大鼠的神经功能得到了明显改善，这一 功能检查结果和形态学检查结果相吻合。 6．应用转基因技术治疗实验性周围神经损伤，技术可行，方法可靠， 效果明显，但如何提高转移基因在体内的表