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柑橘是世界上种植最广泛的水果作物之一,而中国是主要的柑橘生产国,面积和产量均居世界第一。柑橘主要采用无性繁殖栽培,在长期嫁接繁殖过程中容易感染并累积一种或多种病毒;病毒会通过苗木和接穗进行远距离传播,在田间农事操作和媒介昆虫均可导致这些病毒传播扩散,使得果树单产低、寿命短,从而造成重大的经济损失,所以柑橘病毒的检测与鉴定是防治病毒传播的基础。柑橘病毒在植株体内存在分布不均、复制积累量低、季节性差异、潜伏侵染等现象,这些因素限制了传统病毒检测方法鉴定病毒。深度测序(如转录组测序技术)提高了柑橘病毒的鉴定效率,近年开始应用于鉴定柑橘未知病毒或已知病毒。本研究对两种不同的柑橘病毒病进行了高通量测序鉴定,其结果如下所述。利用转录组测序分析,在表现花叶症状的重庆丰都黄金蜜柚样品仅鉴定到与柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)或苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)具有较高的同源性的病毒,表明黄金蜜柚可能感染了ASGV。进一步验证该结果,利用分段RT-PCR和RACE-PCR获得了侵染黄金蜜柚的3个ASGV分离株(ASGV-HJY-1、ASGV-HJY-2和ASGV-HJY-3)全基因组序列。序列分析表明,3个ASGV分离株的基因组全长均为6496 nt,基因组结构等与已知的CTLV、ASGV相同。全基因组序列比对表明,ASGV-HJY-1与ASGV巴西苹果分离株(KX66848)序列相似性最高,为84.0%;ASGV-HJY-2与ASGV中国苹果分离株(KF434636)、ASGV日本苹果分离株(D14495)序列相似性最高,均为92.4%;ASGV-HJY-3与CTLV中国砂糖橘分离株(JQ765412)序列相似性最高,为97.5%。基于基因组的进化分析,ASGV-HJY-1与3个ASGV苹果和梨分离株聚为同簇;ASGV-HJY-2与4个ASGV苹果分离株聚为同簇;ASGV-HJY-3与CTLV柑橘分离株聚在同一簇。基于外壳蛋白(coat protein,CP)核苷酸序列的进化分析,发现进化树聚为3个Group:ASGV-HJY-1与ASGV-HJY-2聚在Group 1中,ASGV-HJY-3聚在Group 2中;比较各个分离株的来源或寄主,发现其CP序列的地理差异和寄主差异不明显。这些分化关系对于研究CTLV、ASGV的起源进化有启示意义。通过生物学分析,20-24℃的常温条件下抽梢的黄金蜜柚叶片表现花叶、皱缩症状,30-35℃的高温条件下抽梢的叶片没有这些症状,RT-PCR和RT-qPCR检测结果显示未表现症状的黄金蜜柚检测不到ASGV,而症状明显的黄金蜜柚均检测到ASGV。高温处理会使得黄金蜜柚中ASGV病毒可能钝化失去活性或者脱除了,因此高温处理后不表现症状。在生物学水平上,初步判断了黄金蜜柚花叶病是由ASGV引起的。琯溪蜜柚接毒后没有明显的症状,与健康植株无明显差异,而黄金蜜柚是由琯溪蜜柚芽变育种,可能琯溪蜜柚中存在某些抗ASGV的机制,黄金蜜柚是ASGV的易感品种。通过田间调查发现重庆、四川、福建、江西的有花叶症状的黄金蜜柚均检测到ASGV,但阳性率存在差异。利用转录组测序分析,在表现叶片斑驳症状的春香杂柑样品中鉴定到一个正单链RNA病毒(暂命名为Haruka-associated Citrivirus,HaCV)。通过转录组学技术和RT-PCR技术,获得了HaCV的全基因组序列。HaCV的基因组全长为8697 nt,HaCV编码3个开放阅读框,与柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)具有最高的相似性,为62.9%。HaCV与已知CLBV分离株比较分析,其具有较短的基因组,主要是由于ORF1缺失11个氨基酸;另外不同的是5’UTR的开始序列为“CGAAAA”,而之前的CLBV都是“GAAAA”;HaCV编码ORF2时没有移码,但是已知的CLBV都存在移码现象。由于HaCV的基因组结构与柑橘病毒属(Citrivirus)的很相似,且在基因组、复制相关蛋白(replicase polyprotein,RP)和CP的系统发育进化树中与CLBV分离株聚在同一个组群,因此认为春香分离株HaCV是Citrivirus属的成员之一。根据国际病毒分类委员会对乙型线形病毒科的分类标准的定义:当RP或CP基因的氨基酸序列相似性低于80%或核苷酸序列相似性低于72%,则认为其是一个新种。基于CP序列分析,HaCV与CLBV分离株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为76.4%-85.6%和87.6%-95.3%,HaCV可能是CLBV的一个新株系。然而,HaCV与不同国家地区的CLBV柑橘分离株的全基因组序列的同源性很低,HaCV的5’UTR和3’UTR的核苷酸序列与已知的CLBV存在明显的差异,另外其RP基因与已知CLBV比较显示核苷酸和氨基酸序列相似性分别为55.0%-55.7%和51.3%-51.9%,显著低于分类标准,基于这些结果,认为HaCV是Citrivirus属的一个新种。