果胶酶是分解果胶质的一类酶的总称,在食品、饲料加工、纺织、造纸、环境保护、诱导植物抗病等方面都有广泛的应用。由于酶的专一性强,针对不同底物寻找果胶酶高产菌株及其基因资源是拓展其应用范围的重要基础。本文采用改良后的水解圈筛选方法,从50份产果胶酶的菌株中复筛出一株果胶酶活性很高的欧文氏杆菌（Erwinia）T85-166菌株。该菌株的发酵液果胶酶活力达213.30 U/mL。本文以欧文氏杆菌T85-166菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法克隆出了该菌株Pectate lyase基因的部分片段（Genbank登录号为:EU597234）。该片段长为877bp,编码290个氨基酸。Blast比对结果显示,该基因片段与Erwinia sp.BTC105 pectate lyase基因的相似性最高（98%）,其次是Erwinia chrysanthemi pelC和pelB基因,相似性分别为94%和87%。将该基因片段连接到pMD18-T载体后,转化大肠杆菌DH5α,采用蓝白斑方法筛选到一菌株pMD18-T-T85-166-Pel。菌落PCR方法证明该菌株为阳性重组菌株,水解圈方法表明该菌株具有果胶酶活性,能成功表达果胶酶。本文根据欧文氏菌株Pel基因在基因组上的分布特点,合理设计引物,采用PCR方法成功克隆出了三个Pel（分别编号为Pel-1、Pel-2、Pel-3）基因的全长序列（Genbank登录号为:FJ572964,EU977133,FJ572965）,分别将全长序列连接到pMD18-T载体后转化大肠杆菌JM109,采用抗生素筛选并结合菌落PCR方法和质粒PCR方法鉴定了各个Pel基因的阳性重组菌。多序列比对结果表明,Pel-1基因的前300个及后250个碱基序列与Pel-2基因高度相似,但与Pel-3基因有显著差异,而中间部分则与Pel-3基因碱基序列高度相似。这种碱基排列方式尚未在欧文氏菌中被报道过。之后,我们分别将各Pel基因亚克隆到受T7/lac启动子严谨调控的pEASY-E1高效表达载体后转化大肠杆菌JM109,以期获得过量表达。