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背景慢性酒精暴露后NMDA受体尤其NR2B亚基表达上调,有研究提示NMDA受体尤其NR2B亚基与酒精依赖相关的各种临床表征关系密切,其中NMDA受体拮抗剂AP-5可抑制酒精条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)的形成,但酒精诱导NR2B基因表达的机制目前尚不清楚。表观遗传修饰是一种介导环境因素和基因组调控基因表达的机制,这种机制参与了包括酒精依赖在内的人类疾病的病理过程。有研究提示,组蛋白修饰参与了酒精诱导NR2B基因表达的调控作用,但NR2B基因表达的组蛋白调控研究结果不一,仍需进一步明确。本研究我们通过建立酒精CPP及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠干预大鼠模型,观察丁酸钠对酒精诱导的大鼠觅药行为及海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达影响,探讨酒精依赖形成即酒精觅药行为的组蛋白修饰机制。目的1.建立酒精CPP及丁酸钠干预大鼠模型,探讨丁酸钠对大鼠酒精依赖形成的影响。2.检测各组大鼠海马NR2B蛋白、NR2BmRNA及NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化表达水平,探讨酒精诱导NR2B基因表达的组蛋白乙酰化修饰机制。3.探讨酒精依赖形成的组蛋白乙酰化修饰机制。方法1.雄性Wistar大鼠80只经CPP测试筛选出自然偏爱黑箱且无明显差异的大鼠48只,运用随机数字表法分为4组(生理盐水+生理盐水组即生理盐水组、丁酸钠+生理盐水组即丁酸钠组、生理盐水+酒精组即酒精组、丁酸钠+酒精组),每组12只,分别给予生理盐水、丁酸钠(200mg/kg)、酒精(10%v/v,0.5g/kg/d)、丁酸钠(200mg/kg)+酒精(10%v/v,0.5g/kg/d)腹腔注射处理建立酒精CPP及丁酸钠干预模型。2.造模后,各组大鼠断头分离出海马组织。采用蛋白印迹(Western-blot)、实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术分别检测各组大鼠海马NR2B蛋白、NR2B mRNA、NR2B基因启动子区H3K9乙酰化的表达水平。结果1.CPP测试结果:各组大鼠CPP测试值、CPP分值组间差异均有统计学意义(F=25.731、20.065,均P<0.05);每组大鼠CPP测试值与CPP基值经配对t检验显示,酒精组、丁酸钠+酒精组测试值显著高于基值(t=5.749、12.621,均p<0.05);生理盐水组、丁酸钠组测试值较基值差异均无统计学意义(t=1.776、0.346,均P>0.05)。酒精组、丁酸钠+酒精组CPP测试值、分值较生理盐水组显著增高(均P<0.05);丁酸钠组CPP测试值、分值较生理盐水组差异均无统计学意义(均P>0.05);丁酸钠+酒精组CPP测试值较酒精组显著增高(P<0.05);丁酸钠+酒精组CPP分值较酒精组一定程度上增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.Western blot结果:各组大鼠海马NR2B蛋白表达水平组间差异有统计学意义(F=12.384,P<0.05);酒精组、丁酸钠+酒精组海马NR2B蛋白表达水平均显著高于生理盐水组(均P<0.05);丁酸钠组海马NR2B蛋白表达水平较生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05);丁酸钠+酒精组海马NR2B蛋白表达水平显著高于酒精组(P<0.05)。3.RT-PCR结果:各组大鼠海马NR2B mRNA表达水平组间差异有统计学意义(F=18.524,P<0.05);酒精组、丁酸钠+酒精组海马NR2B mRNA表达水平均显著高于生理盐水组(均P<0.05);丁酸钠组海马NR2B mRNA表达水平较生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05);丁酸钠+酒精组海马NR2B mRNA表达水平显著高于酒精组(P<0.05)。4.ChIP结果:各组大鼠海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平组间差异有统计学意义(F=22.754,P<0.05);酒精组、丁酸钠+酒精组海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平均显著高于生理盐水组(均P<0.05);丁酸钠组海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平较生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05);丁酸钠+酒精组海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平显著高于酒精组(P<0.05)。5.相关性分析结果:CPP分值与NR2B蛋白表达水平(r=0.474,P<0.05)、NR2B蛋白表达水平与NR2BmRNA表达水平(r=0.468,P<0.05)、NR2BmRNA表达水平与NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平(r=0.596,P<0.05)、CPP分值与NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化表达水平(r=0.542,P<0.05)均呈正相关。结论1.HDAC抑制剂丁酸钠能在一定程度上增强酒精CPP效应及增加海马NR2B基因的表达。2.慢性酒精暴露后上调海马NR2B基因表达,且NR2BmRNA表达水平与NR2B蛋白表达水平呈正相关,NR2B蛋白表达水平与CPP分值呈正相关,提示海马NR2B基因表达上调可能是酒精依赖大鼠觅药行为形成的机制之一。3.慢性酒精暴露后大鼠海马NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化程度升高;且NR2BmRNA与NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平呈正相关,CPP分值与NR2B基因启动子区H3K9乙酰化表达水平呈正相关,提示海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化可能是NR2B基因表达的机制之一,海马NR2B基因启动子区H3K9乙酰化可能参与了酒精依赖大鼠觅药行为形成的表观遗传学机制。