异戊二烯是自然界分布最为广泛、种类最为多样化的大类生物有机化合物-类异戊二烯的合成单体,同时作为合成化学工业的基础原料,被广泛应用于合成橡胶、医药、香料和农药等领域。目前工业上异戊二烯的供应主要依赖于石油基原料,其绿色清洁生产仍然是当前可持续发展战略中的一大挑战。大肠杆菌和酿酒酵母遗传背景清楚、操作简便,是工业生产中的理想模式微生物。因此,本研究采用大肠杆菌和酿酒酵母作为宿主菌,对微生物中异戊二烯的生物合成进行研究。在利用大肠杆菌生物合成异戊二烯的研究中,首先,通过引入外源的异戊二烯合酶在大肠杆菌中构建一条异戊二烯生物合成途径,并通过单个基因的过表达,确定了MEP途径中的关键酶(DXS, DXR和IDI),其影响力顺序为IDI>DXS>DXR;其次,结合不同相容质粒共存体系及多顺反子方法,构建了载体形式的多基因共表达体系,实现了ISPS、DXS、DXR、IDI多个限速酶的共表达,并就多基因协同作用对代谢产物的影响进行了探索；然后,采用基因顺序调控对MEP途径进行了平衡调控,结果发现基因的表达顺序对异戊二烯的终产量具有重要影响,当基因表达顺序与代谢途径顺序一致时,代谢产物积累量最高；最后,结合蛋白质工程和代谢工程,提出了关键酶的共定向进化策略,异戊二烯的生产率提高了60%,达到4.18 mg·g-1·h-1(细胞干重,DCW, Dry Cell Weight).在利用酿酒酵母作为工程菌株生产高附加值生物化学品时,多基因途径的快速、稳定组装是生物合成中的一大瓶颈。为此,我们首先建立了一套即插即用、选择标记可循环使用的整合工具盒pUMRI.为了证实其有效性,将其应用于构建4个基因的β-胡萝卜素合成途径(～10 kb DNA),8个基因的MVA途径(～17 kb DNA)和11个基因的番茄红素生物合成途径(～22 kb DNA)。结合GAL调控系统,最终获得了两株类异戊二烯高产菌株,其中Y-carotene-01菌株的胡萝卜素含量达到16.3 mg/g(DCW), BY4742-C-04菌株的角鲨烯含量达到39 mg/g (DCW)。作为MVA途径的前体物质,乙酰辅酶A的充足供应对于类异戊二烯的积累是非常重要的,为此我们就细胞质和线粒体两个亚细胞结构进行了代谢工程调控。在细胞质的调控中,我们针对MVA途径、乙酰辅酶A合成途径及异戊二烯合成支路三个代谢模块,提出了推-拉-敲的组合调控策略,确定并解除了各个模块中的限速节点。综合调控后异戊二烯的产量达到18.5 mg/L,提高了394倍。在线粒体的调控中,首先,以GFP作为报告基因进行了荧光定位表征,建立了线粒体的基因定位策略。然后,将线粒体定位序列引入pURMI工具盒,在线粒体内构建了一条MVA途径。为了提高异戊二烯的产量并缓解MVA途径在线粒体内构建后造成的中间代谢积累对细胞生长造成的毒性,采用了GAL调控和好氧调控策略,异戊二烯的产量达到133 mg/L,该结果证实了线粒体调控的有效性。最后,将线粒体和细胞质两个亚细胞结构域进行了协同调控,最终异戊二烯的产量达到158 mg/L。本文以多基因表达方法及整合工具的建立为基础,结合蛋白质工程及多种代谢调控策略,有效地提高了微生物中的异戊二烯的生物合成效率,为其工业化生产提供了技术支持。