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研究背景纵观全世界恶性肿瘤中,肺癌无论是发生率抑或死亡率均位居第一,其中以非小细胞肺癌发生率最高,约占肺癌80-85%。近年来随着吸烟与肺癌发生相关性与发病谱悄然改变,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)也从原来最常见的鳞癌(lung squamous carcinoma)逐步演化成以腺癌(lung adenocarcinoma)为主。目前针对NSCLC的治疗策略主要取决于肺癌分期及分子分型,对于早中期肺癌(I-IIIA)主要以外科手术辅以必要系统性治疗为主,而针对晚期肺癌(IIIB-IV)则主要采取综合系统性治疗。对于早中期肺癌,通过外科手术治疗去除肿瘤负荷,可以显著延长患者生存预后甚至在更早期肺癌(非浸润性腺癌或IA期NSCLC)可能达到治愈肿瘤效果。随着分子测序技术飞速发展,对肿瘤认识和治疗也从过去单纯基于组织病理分型逐步延伸至分子分型,在肿瘤发生发展过程中,多个不同(驱动)基因变异相互作用从而介导了肿瘤的进化,这种进化最直观体现就是肿瘤整体异质性。近年来,对于肿瘤异质性研究也逐渐受到关注,对异质性研究方法主要采取多个肿瘤区域测序方法,通过生物信息分析技术根据样本内不同突变类型及丰度等因素区分主干克隆(在不同区域肿瘤均存在变异)和亚克隆(只在一个肿瘤区域内存在变异),从而了解肿瘤整体突变谱及异质性。在晚期肺癌中,异质性是介导原发或继发耐药最主要始动因素,但关于分子演化及肿瘤异质性如何影响早期肺癌演化鲜有相关研究。在早期肺癌中存在两个非常显著转化阶段,其一是从非浸润性的原位癌到浸润性癌发展的阶段,两种阶段存在显著生存预后差异,另一个是从早期独立肺原发灶向中期合并肺内及纵隔淋巴结转移阶段发展,通过对比早期可手术原发灶及转移淋巴结,可有助于理解异质性对整体预后及围术期治疗疗效影响的潜在机制。通过对肿瘤多区域进行二代测序分析及免疫组化评估,我们希望能从基因组学及免疫组学层面去探索两种演化过程主要分子驱动事件及整体免疫微环境对肿瘤演化过程影第一部分早期非浸润性腺癌瘤内异质性及分子演化分析方法1.标本收集与入组标准从2017年1月到2018年4月连续性收集早期肺肿瘤外科手术标本,手术切除标本分开两本部分,分别放入液氮及福尔马林保存,时间控制在标本下来后半小时以内。共收集208例标本,剔除其中38例(15例鳞癌,12例良性肿瘤,4例多发,3例上皮瘤样癌,3例小细胞肺癌,1例腺鳞癌),余下170例中筛选除肿瘤直径小于30mm,且排除病理评估包含除贴壁和腺泡以外的成分,共计30例标本进行相关检测。2.石蜡标本病理再评估及免疫组化对所有需要进行相关检测的标本石蜡部分进行H&E染色,请病理科医生进行评估,同时将剩余石蜡标本进行EGFR,ALK,MET,PD-L1及CD8免疫组化评估。3.冰冻标本核酸提取将冰冻标本置于冰冻切片机中,根据肿块大小选择相隔0.3cm区域分割,分别进行冰冻切片,并按照QIAGEN试剂盒说明进行核酸提取。4.测序建库与质控5.测序数据分析基于测序得到的原始FASTQ及BAM数据通过生物信息技术进行分析,包括突变谱,拷贝数变异,肿瘤突变负荷,克隆突变等。结果在30例标本突变谱中,驱动基因突变以EGFR比例最高43.3%(13/30),TP53仅在微浸润性腺癌(minimally invasive adenocarcinomas,MIA)和浸润性腺癌(invasive adenocarcinoma,IAC)中观察到(35.7%,5/14),而原位腺癌(adenocarcinomas in situ,AIS),在驱动基因突变上AIS与MIA/IAC无显著差异,我们同时对比了TCGA数据库对应早期肺腺癌数据,结果显示东西方人群早期肺癌突变谱存在较大异质性。进一步对比同个肿瘤不同区域的结果看到随着肿瘤病理从非浸润性到浸润性演化的过程中,突变负荷及亚克隆突变比例也在不断增高,拷贝数变异事件也随之增加提示大结构变异导致基因不稳定性可能是浸润性获得其中机制之一。此外通过KEGG信号同路富集分析可以看到MIA和IAC有着区别于AIS富集通路包括刺激肿瘤生长和诱导肿瘤转移等,进一步说明从AIS到MIA存在分子信号通路上侵袭性转化。同时我们也基于不同区域测序结果分析了肿瘤主克隆及亚克隆并结合其分子分型和免疫组化结果,看到在EGFR突变及PD-L1/CD8单阳性状态下,肿瘤亚克隆突变相对较少,提示可能不同驱动基因分型及免疫微环境可能塑造不同肿瘤演化过程。结论早期非浸润性腺癌已具有较高瘤内异质性,其中TP53突变以及拷贝数变异事件累积可能是肿瘤早期浸润性获得重要机制之一,同时不同驱动基因突变及免疫微环境可能影响早期肺腺癌分子演化。第二部分原发肺腺癌与转移淋巴结异质性及转移驱动分子机制探索方法1.标本收集与入组标准从2017年5月到2018年3月连续性收集术中淋巴结冰冻提示阳性的患者共15例,收集术中可疑淋巴结及肿瘤原发灶及正常组织,手术切除标本分两本部分,分别放入液氮及福尔马林保存,时间控制在标本下来后半小时以内。筛选腺癌及淋巴结阳性标本患者6例共31例样本进行相关检测。2.石蜡标本病理再评估及免疫组化对所有需要进行相关检测的标本石蜡部分进行H&E染色,请病理科医生进行评估,同时将剩余石蜡标本进行EGFR,ALK,MET,PD-L1及CD8免疫组化评估。3.冰冻标本核酸提取将冰冻标本置于冰冻切片机中,根据肿块大小选择相隔0.3cm区域分割,分别进行冰冻切片,并按照QIAGEN试剂盒说明进行核酸提取。4.测序建库与质控5.测序数据分析基于测序得到的原始FASTQ及BAM数据通过生物信息技术进行分析,包括突变谱,拷贝数变异,肿瘤突变负荷,克隆突变等。结果31例样本瘤内及瘤间均存在高度异质性,6例患者中包含肿瘤原发灶及淋巴结转移灶最常见驱动突变是EGFR(39.4%),同时观察到与TKI疗效及预后显著相关的MYC(12.1%),TP53(12.1%),MTOR(9.1%)及PIK3CA(9.1%)大部分存在于转移淋巴结中,而在原发灶中相对少见,此外转移淋巴结整体突变负荷及新抗原负荷显著高于原发灶。拷贝数变异整体而言较早期肺癌显著减少,通过KEGG分析显示转移淋巴结较原发灶具有小细胞信号通路富集。对原发灶与转移灶PD-L1及CD8表达进一步评估显示,原发灶与转移灶具有高度一致性免疫微环境表达情况,同时表达水平均较高。此外基于T细胞组库分析显示,转移淋巴结整体Shannon指数较原发灶显著增高,克隆源性显著低于原发灶。结论肺内转移淋巴结与原发灶存在高度异质性,且转移淋巴结具有更强侵袭性分子分型,高度瘤间异质性可能是导致新辅助TKI混合性疗效机制之一。原发灶及转移灶高突变负荷,高新抗原负荷及PD-L1/CD8高表达免疫微环境进一步支持新辅助免疫治疗在局部晚期非小细胞肺癌治疗中临床价值。