第一部分汉黄芩素及咖啡酸乙酯诱导肿瘤细胞凋亡及其作用机制研究　　目的：　　为寻找有效的抗肿瘤药物，使用 HepG2、A549、K562和 MCF7作为实验细胞，分别对筛选获得的汉黄芩素和咖啡酸乙酯进行抗肿瘤作用分析，并对它们诱导肿瘤细胞凋亡的机制与 HDAC1/HADC2、c-Myc/Skp2/Fbw7α通路之间的关系进行探讨，同时初步研究咖啡酸乙酯抑制裸鼠体内 K562移植瘤的作用。　　主要研究方法和结果　　一、汉黄芩素诱导HepG2和A549凋亡及其机制　　1.MTT结果显示，不同浓度（20μg?mL-1~70μg?mL-1，48 h）汉黄芩素处理HepG2和A549，细胞活力呈剂量依赖性下降，对应IC50值分别为45μg?mL-1和35μg?mL-1；倒置显微镜观察普通培养和 HE染色结果显示，HepG2(45μg?mL-1，48 h)细胞变圆，皱缩，失去微绒毛，与邻近细胞分离；DAPI荧光检测结果显示，HepG2(45μg?mL-1，48 h)和 A549(35μg?mL-1，48 h)细胞核均出现典型凋亡小体；流式细胞术进行Annexin V-PI双染的凋亡分析结果表明，HepG2和A549经不同浓度汉黄芩素处理，均呈剂量依赖性促进细胞凋亡；细胞周期检测结果显示，汉黄芩素主要将HepG2细胞阻滞在G2/M期。　　2.Western blot检测蛋白表达结果显示，汉黄芩素（25μg?mL-1，35μg?mL-1，45μg?mL-1，48h）诱导 HepG2细胞凋亡，HDAC1和 HDAC2表达量无明显变化，而PARP剪切产物增加。　　3.JC-1染色分析线粒体膜电位结果显示，A549细胞（15μg?mL-1，25μg?mL-1，35μg?mL-1，48h）线粒体膜电位下降；结合western blot检测结果（Mcl-1下调，AIF和细胞色素c释放到胞质），证实线粒体膜损伤；凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin下调，而 PARP剪切产物增加，证实汉黄芩素诱导 A549细胞凋亡。　　4.qPCR和western blot检测结果显示，A549（15μg?mL-1，25μg?mL-1，35μg?mL-1，48h）细胞内HDAC1、HDAC2、Skp2的mRNA和蛋白均下调，但是c-Myc蛋白下调，而c-Myc的mRNA增加近1.6倍。　　5.c-Myc作为转录因子促进Skp2的表达，而Skp2可通过泛素化降解途径反馈调节c-Myc的水平，本研究结果中，汉黄芩素可以下调Skp2和c-Myc两者的蛋白表达，而c-Myc mRNA上调，可能涉及蛋白酶体降解途径中的另一个靶向 c-Myc的识别亚基 Fbw7；c-Myc Thr58的磷酸化是Fbw7的靶向识别所必须，而其磷酸化由GSK3β介导，所以我们同时观察Fbw7α，p-c-Myc(Thr58)和GSK3β的表达水平。qPCR和 western blot检测结果，Fbw7α mRNA上调，而蛋白下降；p-c-Myc(Thr58)蛋白增加；而 GSK3β的mRNA和蛋白均下调。此外，蛋白酶体降解抑制剂MG132(1μM，48h)不能逆转c-Myc的降解，这可能是Fbw7α和Skp2下调的结果。　　二、咖啡酸乙酯诱导A549、K562和MCF7凋亡及其机制　　1.MTS、DAPI核染色和流式细胞术等实验结果显示，咖啡酸乙酯(40μM~240μM，24h,48 h,72h）呈时间剂量依赖性抑制癌细胞株 A549、K562、MCF7的活力，并引起染色体聚缩、磷脂酰丝氨酸外翻、PI染色加强等典型的凋亡改变。　　2. JC-1染色分析线粒体膜电位结果显示，A549和MCF7(160μM,120μM，48h)线粒体膜电位下降；结合western blot检测结果，Bcl-2家族成员（Mcl-1及 Bcl-2/Bax比例）、凋亡抑制蛋白（IAPs家族成员）Survivin和 XIAP在 A549、MCF7和 K562中下调，而 PARP剪切产物增加，证实咖啡酸乙酯通过影响线粒体膜稳定性，诱发凋亡发挥抗肿瘤作用。　　3.qPCR和western blot检测结果显示，在A549细胞中，c-Myc、Skp2、Fbw7α蛋白下调，c-Myc(Thr58)磷酸化蛋白不变；在K562细胞中，c-Myc、Skp2、Fbw7α和c-Myc(Thr58)磷酸化蛋白均下调；在MCF7细胞中，Skp2和 Fbw7α蛋白下调，而c-Myc、c-Myc(Thr58)磷酸化蛋白上调。　　4.Balb/c裸鼠腋窝皮下注射 K562细胞，构建载瘤裸鼠模型，腹腔注射50mg/kg咖啡酸乙酯，结果显示，咖啡酸乙酯能抑制在体肿瘤的生长，抑瘤率达40％，未观察到裸鼠明显体重下降、精神萎靡甚至死亡等毒性现象。　　结论：　　1.汉黄芩素抑制 HepG2活力并诱导其凋亡，与 HDAC1、HDAC2无关，与 PARP被剪切相关。　　2.汉黄芩素抑制A549活力并诱导其凋亡，与线粒体途径、凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin的下调、PARP的剪切产物增加相关；并通过下调HDAC1/HDAC2及c-Myc/Skp2通路发挥抗A549的作用。　　3.咖啡酸乙酯能抑制A549、K562和MCF7的活力，并影响线粒体膜电位，下调 Mcl-1、Bcl-2/Bax比例、凋亡抑制蛋白Survivin和XIAP，增加PARP剪切产物发挥抗肿瘤作用，促进其凋亡。　　4.c-Myc/Skp2/Fbw7通路在咖啡酸乙酯抗A549、K562和MCF7中具有不同作用。　　5.咖啡酸乙酯能一定程度抑制裸鼠K562移植瘤的生长。　　第二部分基于基因表达谱筛选的药物盐酸硫利达嗪抗 K562作用　　目的　　为寻找治疗 CML的有效药物，基于基因表达谱进行数据分析，并通过 CMap将差异基因与药物作用数据库关联，寻找老药新用法，为发现抗肿瘤药提供新的思路，并初步验证药物药效。　　主要研究方法和结果　　1.GEO数据库查询获得CML数据集GSE24739，并通过BRB-ArrayTools分析差异表达基因，获得差异基因519个，其中上调基因298个，下调基因221个。　　2.将差异基因列表导入CMap，获得 CML的候选治疗药物，对排名前十的药物进行初步的分类，主要有 HDAC抑制剂、精神病类药物及HSP90抑制剂等。　　3.盐酸硫利达嗪是排名第二的药物硫利达嗪的盐酸盐，MTS结果显示，μM盐酸硫利达嗪无明显抑制 K562细胞活力，10M始出现明显抑制，且随药物的浓度增加而呈时间剂量依赖性。流式细胞术进行Annexin V-PI双染分析，结果显示，与对照组相比，盐酸硫利达嗪处理组K562细胞凋亡与坏死部分增加。　　4.qPCR结果显示，15μM盐酸硫利达嗪处理K562细胞12h，PTEN、TNFSF10、SOCS5、CCL5、MAP4K4上调，而WT1、GATA1下调，EIF2S1则无明显变化；与差异基因计算值对比，初步确认盐酸硫利达嗪是通过逆转某部分CML异常表达基因而发挥抗肿瘤作用。　　结论：　　1.基于基因表达谱筛选CML候选治疗药物是缩短药物发现历程，进行“老药新用”的有效途径。　　2.盐酸硫利达嗪能抑制K562的活力，并促进其凋亡与坏死。　　3.盐酸硫利达嗪的抗肿瘤作用与其逆转CML差异基因中的PTEN、TNFSF10、SOCS5、WT1、GATA1相关。