狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)感染引起的一种人畜共患的急性传染病。感染者发病后一旦出现显著的神经系统症状,几乎100%死亡。狂犬病在发展中国家仍是对人类健康的严重威胁。目前对组成狂犬病病毒主要结构蛋白的功能及致病机理的研究仍不完全明确。掌握大量有关病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的信息,将有助于揭示病毒在宿主上的致病过程的机制。然而,缺乏适宜的单克隆或多克隆抗体严重阻碍了我们的研究步伐,适用抗体的开发已成为相关研究的先决条件。本研究首先对NCBI提供的RABV CVS毒株的三个结构蛋白基因的原始序列用JCAT软件进行密码子优化。根据对HEK密码子的偏爱,稀有密码子被HEK偏爱密码子代替,而不改变氨基酸序列,但还要考虑到GC含量以及避免被酶切水解等要素,最终尽可能地使用宿主偏爱的密码子。合成的基因序列的5’和3’末端分别设计有BamHI和EcoRI消化位点,并在5’末端引入了Flag标签,以方便后续的蛋白质纯化。在不表达冗余序列的情况下,在3’端引入了终止密码子,并优化了密码子适应指数(CAI),以增加蛋白质表达。经DNAMAN软件翻译后,确认氨基酸序列同源性为100%。其中RABV G CAI由0.22升至0.79,RABV M CAI由0.21升至0.65,RABV P CAI由0.22升至0.70,序列优化后CAI均得以提高,更有利于目的蛋白在HEK中的表达,并通过WB结果证明密码子优化后的质粒表达量更高。将基因序列优化的真核表达载体转染293T细胞中实现重组蛋白的表达。通过Anti-Flag亲和凝胶纯化、浓缩后,成功真核纯化出RABV M,P,G蛋白,分别的表达水平;将重组蛋白与弗氏佐剂结合,根据合理的免疫程序对Balb/C小鼠进行免疫,并收集血清以制备多克隆抗体。经Western Blot证明了Flag-RABV M、P、G多抗可成功在23KD、40KD、52KD处检测到纯化的RABV M、P、G融合蛋白以及感染细胞中病毒蛋白的表达。在确定蛋白质的良好抗原性的基础上,选择真核表达的RABV M、P和G作为包被蛋白抗原,建立了间接ELISA诊断方法。优化反应条件,并建立阴阳性临界值,评价间接ELISA方法的特异性,可重复性和敏感性。结果表明,抗原的最佳包被量、包被时间分别是500μg、37℃2h;所制备的阳性待检血清最佳稀释度、作用时间分别为为1:32000、37℃1h;最佳封闭液及封闭时间分别为5%脱脂乳、37℃1h;二抗最佳稀释度、作用时间分别是1:1000、37℃1h,底物最佳反应时间为9min。确立了阴阳性临界值0.202。所建立的间接ELISA诊断方法对犬细小病毒、犬冠状病毒、犬瘟热、犬腺病毒阳性血清均无交叉反应,特异性良好,检测出本研究所制备的针对RABV M,P,G蛋白的多抗血清效价均达到1/128000,效用良好,经临床血清与免疫荧光对比检测后,三种多抗符合率均在84%以上。