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家蚕微孢子虫（Nosema bombycis简称N.b.）是细胞内专性原虫类寄生物，通过寄生家蚕蚕体引起家蚕微粒子病病害。由于其具有胚种传染的特性，对蚕桑生产构成极大的威胁，是蚕丝业的唯一检疫对象。本文尝试研究并初步确立了家蚕微粒子病的原位杂交检测技术。 一、家蚕及家蚕微孢子虫基因组DNA的抽提 分别用家蚕卵、家蚕五龄幼虫的后部丝腺及蛹体进行了家蚕基因组DNA的提取，并进行了比较。三种材料均可提取到质量较高的足量家蚕基因组DNA。其中家蚕五龄幼虫后部丝腺提取的家蚕基因组DNA量多质优，而蛹体及卵提取的DNA尽管并不影响一般的分子生物学上的使用，但其基因组DNA溶液中的淡绛紫色不易去除。 分别用碱发芽法及液氮法抽提了家蚕微孢子虫基因组DNA，其中碱发芽法抽提的DNA质量及数量上好于液氮法抽提的DNA。 二、家蚕卵及家蚕微孢子虫中核酸释放技术的探索 将家蚕的卵及家蚕微孢子虫孢子分别依次经过1×PBS（pH 7.8）、0.2mol／L Na2CO3溶液、DNA抽提缓冲液、RNaseA及蛋白酶K等处理，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。实验结果表明，经过该方法处理，其核酸可以分别从家蚕卵及家蚕微孢子虫孢子中释放出来。 三、家蚕单粒卵及蚁蚕原位杂交方法的探索 将分别催青1d、3d、5d、7d的家蚕卵及刚孵化的蚁蚕经过研磨直接点样于杂交膜，然后将点样的杂交膜依次经过蛋白酶K、NaOH、缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、氯仿：异戊醇（24：1）溶液及NaCl溶液等处理，与34 nt寡核苷酸探针进行原位杂交。1d、3d、5d、7d的家蚕卵、蚁蚕及阳性对照均有杂交信号，而阴性对照无杂交信号。结果表明，家蚕单粒卵及蚁蚕原位杂交方法是可行的。 四、家蚕微孢子虫的特异性检测探针的建立 设计合成了一个26 nt寡核苷酸，用末端标记法标记为探针Ⅰ；同时用PCR方法从微孢子虫基因组DNA上扩增了一个长1.2kb DNA片段，用随机引物法标记为探针Ⅱ。实验结果表明，这两组探针对家蚕微孢子虫基因组DNA有很强的杂交信号，而对家蚕 中 文 摘 要 及E．Colt基因组DNA无杂交信号，其特异性良好，均可以作为检测家蚕微抱子虫的特 异性探针。研究比较了两种探针的核酸杂交灵敏度，探针1可以检测到 11．5 ng的家蚕微 抱子虫 DNA量，探针＊则可以检测到 1．4 ng的家蚕微抱子虫 DNA量。比较研究了两者 使用的适宜量，探针1使用的终浓度以 4 pmol／L较好，而探针＊使用的终浓度为 50 ng／ml 时则比较理想。 五、家蚕卵及感染微抱子虫家蚕幼虫的原位杂交检测 用探针＊对混合在单粒家蚕卵中微抱子虫抱子作原位杂交检测，可以最低检测到约 296粒抱子；对感染家蚕微抱子虫 4d、6d及 10d的幼虫进行原位杂交检测，也均有阳 性杂交信号出现。后者同时也分别用PCR、斑点杂交等检测手段进行了辅助验证，证 明上述家蚕微粒子虫的原位杂交检测结果是可信的。 本文尝试建立的家蚕微抱子虫原位杂交检测技术，为今后能从单个体水平多样本同 时检测诊断家蚕微抱子虫病技术的建立打下了基础。