为了制备及检测纯化的转基因细胞系,本研究利用PCR和基因体外重组技术构建了嗜热菌糖苷酶原核表达载体,采用组织块贴壁法成功建立了牛乳腺上皮细胞培养体系。首先经PCR扩增从真核表达载体p93713中克隆嗜热菌糖苷酶LacS基因,然后将其与pMD19-T载体及pASK-IBA2载体经体外基因重组技术构建了原核表达载体pASK-IBA2-LacS,转化大肠杆菌Rosseta,经去水四环素诱导表达重组蛋白。设计了两条多肽与载体蛋白KLH偶联,定期免疫实验动物,抽取血液,离心得到多克隆抗体血清,对纯化后的抗体进行ELISA及Western blot检测。采用组织块贴壁法成功分离、培养了牛乳腺上皮细胞;利用细胞角蛋白K14和K15的荧光免疫染色法对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对接种细胞存活率、倍增时间、生长曲线等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的牛乳腺上皮细胞系。Western-blot检测、鉴定了未转基因的牛乳腺上皮细胞。牛乳腺上皮细胞系的成功构建,为后续转基因动物生产的研究及细胞水平检测目的基因的表达奠定了必要的基础。