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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)能够感染牛、羊、猪等多种动物,且产生持续性感染,长期危害我国畜牧业健康发展并造成严重经济损失。纳米抗体具有水溶性强、稳定性高、亲和力高、免疫原性弱等优势,在疾病的检测与治疗、食品安全分析等领域广泛研究应用,成为生命科学研究领域的一个热点。目的:利用原核表达系统获得抗BVDV纳米抗体,筛选和纯化BVDV多克隆抗体,建立一种基于抗BVDV纳米抗体的双抗夹心ELISA检测方法。方法:1.在本实验室前期的工作中,成功筛选获得两个抗BVDV纳米抗体Nanobody11和Nanobody12,使用基因合成法分别获得纳米抗体基因。2.构建原核表达载体,获得并纯化Nanobody11和Nanobody12蛋白。3.通过Western Blot和间接ELISA方法验证抗纳米抗体Nanobody11和Nanobody12与BVDV抗原蛋白结合能力。4.使用BVDV灭活病毒免疫羊驼,利用?KTA avant蛋白纯化仪纯化免疫血清中的多克隆抗体;利用抗原亲和层析,分别使BVDV抗原蛋白(E0、E2、NS2-3、NS5A)与Ni+SEPHAROSE 6 Fast Flow填料偶联,再通过重力柱洗脱出特异性多克隆抗体。5.将Nanobody11与生物素缀合,获得Bio-Nanobody11,同时将Nanobody12、E0多克隆抗体、E2多克隆抗体、NS2-3多克隆抗体、NS5A多克隆抗体以及羊驼血清多克隆抗体分别连接辣根过氧化物酶。6.利用抗BVDV纳米抗体Nanobody11、Nanobody12和纯化的5种BVDV多克隆抗体,通过依次确定最佳包被量、最佳封闭液、最佳样品稀释度,以及最佳酶标抗体稀释度,初步建立用于检测BVDV抗原的双抗夹心ELISA方法。结果:1.成功构建抗BVDV纳米抗体Nanobody11和Nanobody12的原核表达系统,并获得与BVDV抗原蛋白E0有反应原性的Nanobody11和Nanobody12蛋白,浓度分别为0.326 mg/mL和0.317 mg/mL。2.纯化获得BVDV羊驼血清多克隆抗体,以及抗E0、E2、NS2-3和NS5A多克隆抗体。抗体浓度依次为6.744 mg/mL、3.301 mg/mL、3.483 mg/mL、1.834 mg/mL、2.733mg/mL。3.利用Bio-Nanobody11和HRP-E2多克隆抗体,初步建立了基于BVDV纳米抗体双抗夹心ELISA检测方法。结论:1.成功纯化抗BVDV纳米抗体Nanobody11和Nanobody12,并证明其与只BVDV抗原E0蛋白产生反应原性。2.成功获得抗E0、E2、NS2-3和NS5A多克隆抗体。3.使用Bio-Nanobody11和E2多克隆抗体,建立了基于抗BVDV纳米抗体双抗夹心ELISA检测方法。