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第一部分谷氨酰胺转运体ASCT2在MYCN扩增的神经母细胞瘤中的生物学功能研究背景和目的：神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是儿童中常发的实体肿瘤。约25%的肿瘤病患癌基因MYCN扩增。MYCN扩增的NB预后差,对常规化疗药物高度耐药。目前尚无理想药物有效治疗癌患群体。进一步深入研究此类肿瘤发生发展的分子机制,寻找新的药物靶点,意义重大。我们前期研究发现MYCN扩增的NB细胞对谷氨酰胺成瘾,需要大量外源性谷氨酰胺赖以存活。谷氨酰胺成瘾使得MYCN扩增的NB细胞必须依赖活跃的转运体系补给生长存活所需的谷氨酰胺。然而,MYCN扩增的NB通过何种载体转运谷氨酰胺及其确切的分子调控机制如何,目前尚不清楚。本研究发现ASCT2(solute carrier family5, SLC1A5)是负责MYCN扩增的NB细胞中谷氨酰胺转运的关键载体。因此,这部分我们旨在深入研究ASCT2在MYCN扩增的NB中的生物学功能,以期为抗癌药物研发提供新的靶标。方法：MYYCN扩增的NB细胞株Kelly. BE-2C和NLF作为体外细胞模型,采用细胞记数仪检测细胞生长情况,结晶紫染色检测克隆形成,台酚蓝染色检测细胞活力,采用PI-Annexin V试剂盒检测细胞凋亡率,BrdU法检测细胞周期,氨基酸摄取实验测定[3H]-L-谷氨酰胺摄取率变化,代谢分析试剂盒检测细胞体内谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平；采用RNA干扰抑制ASCT2基因表达,荧光定量PCR法及Western-blot法检验基因表达受抑制情况,同时Western-blot法检测ASCT2沉默后p70S6K、p4E-BP1表达量的变化,采用裸鼠移植瘤模型,测量瘤重变化,通过免疫组化检测肿瘤组织中PCNA和c-Caspase-3的表达量的变化。结果：1.谷氨酰胺缺失细胞生长和存活明显抑制,克隆形成明显减少,α-酮戊二酸(α-KG)或者非必需氨基酸(NEAA)能明显的挽救谷氨酰胺剥夺引起的细胞死亡,但是并不能恢复细胞的增殖能力,但同时补充α-KG和NEAA能完全恢复细胞的增；2.天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺明显抑制细胞的谷氨酰胺摄取,BCH、MeA1B、组氨酸对其摄取没有影响,L-γ-谷氨酰对硝基苯胺(GPNA)浓度依赖性抑制谷氨酰胺摄取；3.沉默三株细胞的ASCT2基因,谷氨酰胺的摄取率均下降50%以上,细胞体内谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平明显下降；4.成功构建ASCT2表达沉默的稳定细胞系,ASCT2的mRNA和蛋白水平均显著下降,其抑制率大于80%左右,ASCT2基因沉默三株细胞的生长明显抑制,检测kelly细胞的凋亡率,发现缺失40hr的细胞凋亡率增加了29.71%,G1期细胞比例明显增大,S期细胞比例降低。ASCT2沉默后70S6、70S6K、4E-BP1的磷酸化水平明显下降,表明ASCT2在nTORC1信号通路的激活过程中发挥重要作用；5.稳定敲除ASCT2的神经母细胞瘤体生长显著缓慢于空载体对照组,其肿瘤组织中PCNA表达下降,c-Caspase-3升高,表明ASCT2沉默后通过抑制肿瘤细胞增殖,促使凋亡从而抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力。结论：1.MYCN扩增的NB细胞依赖提高的谷氨酰胺代谢维持细胞的增殖和存活；2. ASCT2主要介导MYCN扩增的NB的谷氨酰胺转运；3. ASCT2对于MYCN扩增的NB细胞mTORC1信号通路的激活和三羧酸循环的回补是必需的；4. ASCT2功能缺失显著抑制MYCN扩增的NB细胞增殖和存活,抑制体内肿瘤的发生,证实ASCT2在MYCN扩增NB的发生发展过程中发挥重要作用,我们的研究结果表明,ASCT2可作为治疗MYCN扩增的NB的潜在靶点。第二部分N-Myc和ATF4对ASCT2勺调控机制及临床意义的研究背景和目的：我们在第一部分研究中证实ASCT2是维持MYCN扩增的NB细胞谷氨酰胺转运的关键因子。然而其调控机制如何?我们发现MYCN高拷贝和高风险神经母细胞瘤的ASCT2表达显著增高,表明N-Myc可能调控ASCT2的表达。但癌基因MYC是调控肿瘤细胞过表达ASCT2的唯一关键因子吗?通过信息生物学分析,我们发现活化转录因子-4(ATF4)可能是参与ASCT2表达调控的另一关键因子。这些结果与临床分期和预后是否存在相关性?因此这一部分我们将深入研究N-Myc和ATF4对ASCT2的调控作用机制及其临床意义。方法：荧光定量PCR法、Western-blot法检测验证N-Myc,ATF4对细胞内源性ASCT2表达的影响和应激状态下ASCT2mRNA表达水平的变化,采用生物信息学方法分析ASCT2上的潜在结合位点,构建N-Myc, ATF4与ASCT2基因结合的潜在位点的野生型与突变型荧光素酶报告基因质粒,检测相对荧光素酶活性的变化,研究N-Myc, ATF4对ASCT2转录活性的影响,通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)研究N-Myc, ATF4与ASCT2DNA动态的相互作用。通过NB的临床样本基因芯片(microarray)分析NB的ASCT2, MYCN和ATF4mRNA表达,利用http://pob.abcc.ncifcrf. gov/cgi-bin/JK网站的NB基因芯片数据库的整合分析(Meta-Analysis)结果研究ASCT2与NB预后关系,采用免疫组织化学法(IHC)检测NB病理组织切片中N-Myc,ATF4,ASCT2,PCNA蛋白的表达。结果：1.MYCN基因沉默时,无论是mRNA水平还是蛋白水平,其ASCT2的表达量均会下降,有统计学意义(P<0.001),N-Myc可直接结合在ASCT2启动子区域,在转录水平促进ASCT2的表达；2.在葡萄糖、谷氨酰胺缺失和衣霉素(tunicamycin,Tm)作用下,ASCT2mRNA表达水平显著升高,而低氧条件下ASCT2的表达没有变化；3.ATF4基因时沉默,当谷氨酰胺缺失其ASCT2的表达不再呈升高趋势,与对照组在谷氨酰胺缺失时相比显著下降(P<0.001),ATF4蛋白在应激和非应激状态下能够与ASCT2的第一个内含子上结合位点直接相互作用并激活其表达；4.与MYCN单拷贝或者风险度较低的NB样本相比,MYCN扩增的高危组的肿瘤组织中的MYCN、ASCT2、ATF4mRNA的相对表达显著升高(P<0.001)；5. ASCT2基因表达高的病例在Kaplan-Meier生存曲线分析中显示出较短的生存时间；6. N-Myc、ATF4、ASCT2、PCNA在三例Ⅰ期分化程度比较好的NB组织中表达量都很低,而在13例分化差的样品中其表达都较高。结论：转录因子N-Myc直接激活ASCT2表达,ATF4在应激和非应激状态下均可直接激活ASCT2表达。N-Myc和ATF4共同参与ASCT2的调控促进NB的恶性演化。ASCT2与NB的恶性程度以及不良预后呈显著正相关,表明ASCT2可作为临床诊断和预后判断的一个新的分子标志物。