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背景慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是以一种成熟髓系细胞异常增殖为主的恶性克隆性骨髓增生性疾病,其特征性表现为t（9;22）易位形成Bcr/Abl1融合基因。CML自然病程分为慢性期、加速期和急变期。近年来,伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）的广泛应用,极大程度改善了CML患者的预后。但部分患者对TKIs耐药,导致TKIs不能完全阻止CML的进展。此外,CML一旦进展至急变期,TKIs治疗效果不佳,死亡率增高。目前,CML患者TKIs耐药及急变相关机制尚未完全阐明,因此探讨CML耐药及急变过程中的分子机制,寻找新型治疗靶点,成为目前CML研究的重点。近年来,表观遗传学在肿瘤分子靶向治疗方面取得的一些新突破,也为CML治疗提供了新思路,N~6-甲基腺苷（N~6-methyladenine,m~6A）修饰是真核生物中丰度最高的m RNA修饰,是由甲基转移酶复合体、去甲基化酶和识别蛋白共同调控的动态可逆的修饰过程,参与生长、生殖、减数分裂等生物学过程的调控。研究显示,m~6A修饰及其调控基因的异常与血液肿瘤的增殖、凋亡以及耐药等恶性生物学表型密切相关。KIAA1429是一种m~6A甲基转移酶,具有催化m~6A甲基化等多种生物学功能,在多种肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色,但其在CML中的研究尚未见报道。因此本研究主要从病例、分子、细胞及动物四个层面,分析KIAA1429在CML中表达特点,阐明KIAA1429/YTHDF1 m~6A轴调控RAB27B表达促进CML细胞恶性表型的分子机制,并寻找抑制KIAA1429的抗肿瘤药物。相关研究结果将为CML的治疗提供新的靶标和实验依据。第一部分KIAA1429在CML中的表达及其对细胞生物学行为的影响目的:探讨KIAA1429在CML中的表达及其对CML细胞生物学行为的影响。方法:采用比色法检测CML患者外周血单个核细胞（PBMCs）及CML细胞系总RNA m~6A水平,采用实时定量荧光PCR（RT-q PCR）、Western blot及免疫组化检测CML患者PBMCs中KIAA1429 m RNA和蛋白表达。选取CML细胞株K562、KCL22和伊马替尼耐药细胞株K562/G01,利用慢病毒转染法,构建过表达或沉默KIAA1429的CML细胞模型,通过CCK-8法、Ed U染色、流式细胞术、瑞-吉染色及Transwell实验检测干预KIAA1429对CML细胞增殖、凋亡、迁移以及细胞形态学等生物学行为的影响。并通过IC50检测过表达或沉默KIAA1429对CML细胞伊马替尼耐药能力的影响。结果:CML急变期患者PBMCs中总m~6A水平较CML慢性期患者显著上调,K562/G01细胞总m~6A水平较K562及KCL22细胞显著上调。KIAA1429在CML急变期患者中较CML慢性期患者表达显著上调,K562/G01细胞中KIAA1429水平表达显著高于K562及KCL22细胞。过表达KIAA1429可上调CML细胞RNA总m~6A水平,促进CML细胞增殖、迁移以及伊马替尼耐药能力,抑制细胞凋亡及分化。沉默KIAA1429可下调CML细胞RNA总m~6A水平,抑制CML细胞增殖、迁移以及伊马替尼耐药能力,促进细胞凋亡及分化。结论:CML急变期患者总m~6A水平及KIAA1429表达水平显著上调,KIAA1429能促进CML细胞的增殖、迁移以及伊马替尼耐药能力。表明KIAA1429是CML的促癌基因。第二部分KIAA1429/YTHDF1 m~6A轴通过介导RAB27B m RNA稳定性促进CML细胞恶性生物学行为的机制目的:体外和体内实验相结合,探讨KIAA1429/YTHDF1 m~6A轴通过调控RAB27B促进CML细胞恶性生物学行为的机制。方法:收集沉默KIAA1429的K562细胞和对照细胞进行RNA-seq鉴定,联合Me RIP-seq筛选KIAA1429下游发生m~6A修饰的靶基因。采用RT-q PCR检测CML患者中KIAA1429靶基因RAB27B m RNA表达水平,并进行相关性分析。采用RT-q PCR和Western blot检测干预KIAA1429对RAB27B的m RNA和蛋白表达的影响。通过RIP-q PCR验证KIAA1429与其靶基因RAB27B的结合情况。构建沉默RAB27B的慢病毒载体,转染K562细胞,检测细胞增殖、凋亡、迁移、耐药能力及药物外排变化。通过“回复”实验,观察在CML细胞中沉默RAB27B的表达,是否能够“回复”过表达KIAA1429对CML恶性生物学行为的促进作用。构建沉默YTHDF1的慢病毒载体,转染K562细胞,采用RT-q PCR、Western blot检测沉默YTHDF1后,RAB27B m RNA及蛋白表达量的变化。通过RIP-q PCR验证YTHDF1蛋白与RAB27B的结合情况。利用沉默KIAA1429、沉默RAB27B及沉默YTHDF1的CML细胞系构建瘤裸鼠模型,检测肿瘤体积、裸鼠体重等变化,评估沉默目的基因表达对CML细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响。结果:RAB27B在CML急变期患者较CML慢性期患者表达上调,与KIAA1429表达呈正相关。沉默KIAA1429能降低RAB27B m RNA的稳定性,下调RAB27B表达,RIP-q PCR证实KIAA1429蛋白能直接结合RAB27B m RNA。沉默RAB27B能抑制CML细胞增殖、迁移,导致细胞发生S期阻滞,抑制伊马替尼药物外排,降低细胞伊马替尼耐药性。功能回复实验表明,沉默RAB27B能够部分逆转KIAA1429过表达对CML细胞恶性表型的促进作用。RAB27B和YTHDF1表达量呈正相关,沉默YTHDF1可降低RAB27B m RNA稳定性,进而降低RAB27B m RNA及蛋白表达量。RIP-q PCR证实YTHDF1能够直接结合RAB27B m RNA。与对照组相比,沉默KIAA1429、沉默RAB27B和沉默YTHDF1组小鼠成瘤率及肿瘤体积均显著下降,抑制了K562细胞在裸鼠体内成瘤能力。结论:KIAA1429/YTHDF1 m~6A轴可通过介导RAB27B m RNA稳定性上调RAB27B表达,并促进CML发生发展。第三部分瑞卡帕布（Rucaparib）可抑制KIAA1429表达,并抑制CML细胞增殖,促进细胞凋亡目的:通过体内外实验探讨瑞卡帕布（Rucaparib）对KIAA1429表达及CML发生发展的影响。方法:采用生物信息学分析预测与KIAA1492有相似分子机制的抗肿瘤药物及小分子化合物,并确定Rucaparib作为候选药物。浓度梯度Rucaparib处理CML细胞后,采用RT-q PCR、Western blot检测KIAA1429 m RNA和蛋白的表达水平,通过CCK-8、流式细胞术及IC50检测其增殖、凋亡及耐药浓度。Rucaparib及伊马替尼联合处理CML细胞,通过CCK-8、流式细胞术及IC50检测其增殖、凋亡及耐药浓度。对裸鼠进行Rucaparib药物实验,通过检测肿瘤体积、裸鼠体重等变化,评估Rucaparib在体内对CML治疗效果。结果:生物信息学预测显示,对照组较KIAA1429沉默组对抗肿瘤药物Ponatinib、Rucaparib、Axitinib和ATRA更敏感。Rucaparib能够以剂量依赖的方式抑制CML细胞增殖,促进CML细胞凋亡。经Rucaparib处理后,CML细胞中KIAA1429 m RNA及蛋白表达水平均下调,下调程度和Rucaparib浓度呈正相关。Rucaparib和伊马替尼联合使用,能够降低CML细胞的伊马替尼耐药IC50,且CML细胞株凋亡率较二者分别单独使用显著增高。与对照组相比,Rucaparib给药组裸鼠肿瘤体积增长速度显著下降,Rucaparib能够抑制CML细胞的体内成瘤作用。结论:Rucaparib能抑制KIAA1429表达,抑制CML细胞增殖,促进细胞凋亡,和伊马替尼联用能提高CML细胞对伊马替尼敏感性。Rucaparib在体内可抑制CML细胞成瘤能力,为Rucaparib用于CML的临床治疗提供理论依据,也为CML的伊马替尼耐药提供新的选择。