肌强直综合征(Myotonic myopathies,MM)是一组原发/继发离子通道蛋白(CL-/Na+/Ca2+/K+)结构/功能异常、骨骼肌细胞膜去极化紊乱、持续重复放电的遗传性骨骼肌疾病,临床表现为:肌肉僵直/肌强直、肌肉萎缩/肥大、肌无力;电生理呈典型肌强直电位,伴/不伴肌病电位。根据临床症状分为萎缩性肌强直(Dystrophic myotonia,DM)及非萎缩性肌强直(Non-dystrophic myotonias,NDMs)。萎缩性肌强直亦称“强直性肌营养不良”(Myotonic dystrophies,DMs),呈常染色体显性遗传(Autosomal dominant,AD),全球发病率2.45~5.5/10万,分为强直性肌营养不良Ⅰ型(Dystrophia myotonica 1,DM1)及强直性肌营养不良Ⅱ型(Dystrophia myotonica2,DM2)两个亚型。DM1致病基因为DMPK,定位于19q13.3,3’端非编码UTR区的(CTG)n重复序列异常扩增产生“RNA细胞毒性”作用,继发引起骨骼肌细胞膜氯离子(CLC-1)通道蛋白m RNA剪切缺陷-转录本异常-骨骼肌细胞膜上CLC-1通道蛋白功能异常CL-电流幅度下降,骨骼肌细胞持续收缩导致肌强直症状。除引起DMs骨骼肌症状外,“RNA毒性聚集灶”还通过影响其他组织细胞蛋白pre-m RNA选择性剪切过程,导致剪接产物“不相称”表达,出现心脏、内分泌、中枢神经等多系统受累,使本病呈“合成表型”临床表现。DM2致病基因Znf9,定位于3q21.3,1号内含子(CCTG)n重复序列异常扩增致病。研究证实:DM2与DM1发病机制相同且临床表型相似。非萎缩性肌强直(Non-Myotonic dystrophies,NDMs)是一组离子通道蛋白亚单位编码基因变异,骨骼肌细胞膜兴奋性增高持续重复放电为特征的一组遗传性骨骼肌疾病。综合发病率约<1:100,000。临床表现肌强直、肌容过饱满(运动员体魄)、肌无力(持续/周期性发作)、易疲劳,可伴疼痛,偶累及心脏、呼吸功能。根据致病基因、编码蛋白、临床表型分为先天性肌强直(Myotonia congenital,MC)、先天性副肌强直(Paramyotonia congenital,PC)、高钾型周期性瘫痪伴肌强直(Hyperkalemic periodic paralysis,Hyper PP),钾加重型肌强直(Potassium-aggravated myotonia,PAM)、低钾型周期性瘫痪(Hypokalemic periodic paralysis,Hypo PP)伴肌强直。MC根据遗传方式分为AD遗传-Thomsen’s肌强直(DMC)及AR遗传-Becker’s肌强直(RMC)。发病率为0.3~0.6/10万,致病基因CLCN-1,位于7q35,编码CLC-1蛋白,分布在骨骼肌、心肌等部位。CLCN-1变异致CL-通道抑制性去极化改变、CL-电流抑制减弱出现肌强直症状。基本临床表现:肌强直(叩击性“肌球”,握拳伸直困难),部分患者伴肌容饱满,“加温”现象。PC呈AD遗传,亚洲人群发病报道较少,欧洲发病率约1/350,000-380,000。致病基因SCN4A,位于17q23.1-25.3,编码Na+通道α亚单位,广泛分布在骨骼肌、心肌及周围神经系统。SCN4A变异致α-Na+通道功能获得性改变-Na+持续进入肌细胞内,肌细胞膜去极化延长,临床出现肌强直症状。PC多10岁前发病,突发/遇冷诱发性肌强直、运动后加重肌强直起病。Hyper PP、PAM与PC互为等位基因病。PAM是一组AD遗传性骨骼肌疾病。SCN4A基因变异-Na+电流异常,同时影响K+去极化-骨骼肌细胞舒张障碍。临床表现寒冷、饥饿、精神紧张等因素诱发的肌强直。基因-临床表型相关性使该组疾病呈现较强的临床/遗传异质性。家族性低钾性周期性瘫痪(Family Hypokalemic periodic paralysis,FHypo PP)、Anderson低钾性周期性瘫痪、恶性高热和中央轴空病互为等位基因病。CACNA1S基因变异致病,呈AD遗传,CACNA1S定位于1q31-32,长度90Kb,由44个外显子组成编码骨骼肌CACNA1S受体,分布于心肌、骨骼肌、周围神经系统及中枢神经系统。CACNA1S变异与SCN4A相似性,基因变异影响通道失活,但并不影响依赖电压的激活过程。电生理检查对肌强直综合征诊断有重要意义。电生理均呈现肌强直电位。致病基因差异导致短时肌肉运动后的复合肌肉动作电位振幅瞬时改存在差异,如:MC肌肉运动停止时动作电位振幅迅速恢复到基线水平;PC肌肉运动停止时延迟返回基线。而DMs肌电图呈典型肌强直电位与肌病电位的双重表现。活检骨骼肌病理证实:DMs可见肌纤维直径大小不一,肥大肌纤维、分裂肌纤维增多,无神经支配的小角化改变;变性、坏死、再生肌纤维少见,典型核内移、核聚集、肌浆块等退行性改变。DM1与DM2不同分子遗传学基础使其受累肌纤维有所不同,如:DM1以I型纤维萎缩为主,II型肌纤维相对优势;DM2以II型肌纤维萎缩为主,呈现明显的I型纤维优势。NDMs活检骨骼肌正常/轻度肌源性改变。但上述骨骼肌病理改变并非该组疾病特异性病理结构改变。因此,很难通过活检骨骼肌病理结构进行精准诊断及鉴别诊断。精准测序技术及二代测序技术为肌强直综合征分型诊断及鉴别诊断带来了高效、突破性进展。尤其是对于NDMs分型及鉴别诊断。但DMs属核苷酸重复序列变性病,理论上聚合酶连式反应(Polymerase chain reaction,PCR)可明确异常扩增重复序列数(致病性),但大片段致病重复序列数及模板本身高GC含量形成的复杂二级结构限制扩增反应;重复序列动态突变形成的不稳定性等因素大大限制了酶反应活性,使简洁、高效DMs分子诊断仍存在难度。本研究基于骨骼肌遗传资源标本库(2004.9-2014.12),从1356例骨骼肌疾病筛选强直性肌营养不良(25例,含6例家系)、非萎缩性肌强直(17例,含5例家系),进行肌强直综合征的临床及分子生物学研究,旨在建立DMs及NDMs分子生物学诊断平台,报告中国人群肌强直综合征基因变异特点,回顾性分析临床及骨骼肌病理特点,丰富肌强直综合征的临床表型及遗传表型,尝试钠通道阻滞剂(卡马西平/美西律)治疗肌强直综合征,减轻临床症状,为产前诊断提供分子生物学依据。第一部分优化PCR应用于强直性肌营养不良分子生物学诊断目的:DMs由DMPK(DM1)/Znf9(DM2)非编码区(CTG)n/(CCTG)n核苷酸重复序列异常扩增致病。DMPK由3’-UTR(CTG)n异常重复扩增致病。正常人n=5~37,n>38即为异常,n=38~49突变前等位基因(Premutation alleles);n=50~100原突变等位基因(Protomutation alleles),因此n<100无显著临床症状;n=100~40000突变等位基因(Mutation alleles)。DM1具备典型“遗传早现”及“Parental-gender effect”效应,通过(CTG)n重复序列数可进行临床表型及发病年龄预测。DM2由Znf9 1号内含子区域(TG)n(TCTG)n(CCTG)n结构中(CCTG)n片段异常重复扩增致病。正常人n=26~44;患者n=75~11000以上,平均为5000次。(CCTG)n重复数明确多用于该病诊断及鉴别诊断。DMs高度临床/遗传异质性以及基因变异特点,使PCR方法检测核苷酸重复序列数成为其最终诊断的可靠方法。大片段核苷酸序列的扩增及模板高GC含量对扩增效率的影响显著限制PCR诊断效率,建立符合DM基因变异特点的分子生物诊断方法是临床的迫切需求,优化传统PCR引物序列,变性、退火及延长等反应程序检测核苷酸重复序列数目,是本研究的技术关键。方法1根据International Myotonic Dystrophy Consotium诊断标准在2004-2014年遗传性骨骼肌疾病资料标本库中标本筛选42例肌强直综合征患者(11例家系)作为优化PCR检测对象。2基因分析①签署知情同意书,抽取2ml外周静脉血提取基因组DNA。以Primer5.0软件进行PCR反应引物序列设计,覆盖DMPK,ZNF9基因全长。②传统PCR反应参数优化,包括变性、退火、延伸阶段时间、温度。③对上述入选病例及家系成员进行DMPK及Znf9扩增,2.5%琼脂糖凝胶电泳进行产物分离纯化,DHPLC进行DMs杂合/纯合样品检测验证④ABI377自动测序仪进行测序分析,将测序结果以Sequencher 4.90软件正常人类基因组参照序列进行比对分析。结果1最终引物序列:DMPK(450bp):Forward primer: 5’-CGA CTC CGG GGC CCC GTT GGA AGA CT-3’;Reverse primer: 5’-CTC CCC AGA GCA GGG CGT CAT GCA CAA G-3’;ZNF9(295bp):Forward primer: 5’-GGC CTT ATA ACC ATG CAA AT-3’;Reverse primer: 5’-GCC TAG GGG ACA AA GTGAGA-3’;2优化传统PCR反应程序:①优化DMPK循环参数:预变性:95°C,5 min;变性:95°C,45 s;退火:66°C,8 s;延伸:78°C,3min;30个循环;最终延伸:72°C,10 min;②优化Znf9循环参数:预变性:95°C,5 min;变性:95°C,45 s;退火:65°C,8 s;延伸:75°C,3min;30个循环;最终延伸:72°C,10 min;③循环体系最终确立:应用Dy NAzyme EXT DNA polymerase PCR(Finnzymes,Espoo,Finland)扩增增反应试剂盒。配置反应体系(25μl):(冰浴操作)10×Optimital Dy Nazyme Ex T buffer 2.5μlDy NAzyme EXT DNA polymerase 1.5 μl10m M d NTP(200 u M) 2 μlPCR Forward Primer(10 p M) 1 μLPCR Reverse Primer(10 p M) 1 μLd H2 O 15 μLc DNA 2.0 μL反应体系中不添加任何辅助添加剂。④DHPLC纯合/杂合检测应用优化PCR对入选42例肌强直综合征患者进行DMPK片段扩增,DHPLC对扩增产物进行纯合/杂合分析,20例患者杂合子样本除外DM1;22例纯合样本,不能除外DM13基因诊断分型:应用优化PCR对42例入选样本进行基因诊断分型,22例DMPK纯和样本;20例DMPK杂合样本。2.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。正常对照PCR扩增产物450bp,(CTG)n重复数约为20。22例患者(CTG)n重复数53-683,平均CTG)n重复序列数约535。对17例先证者家系成员进行(CTG)n重复数检测,证实5例女性患者的儿子(CTG)n异常扩增,平均(CTG)n重复数约520次。1例男性患者母亲及小姨(CTG)n重复序列数分别为103、180次。优化传统PCR对3例杂合样本及4例无关对照个体进行Znf9扩增,2.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。正常对照PCR扩增产物295bp,(CCTG)n重复数约为20次。结果示3例患者(CCTG)n重复序列数400-450次,平均(CCTG)n重复序列数约416次。17例样本DMPK及Znf9阴性。结论1高GC含量样本在PCR反应引物序列设计时,设定较高退火温度(Tm)可有效降低G反应能,提高PCR扩增反应效率。2高GC含量样本的PCR反应程序设定,缩短退火时间、提高退火温度、增加延伸反应时间及升高延伸温度能有效提高扩增效率。3本研究优化PCR反应,建立了高效、经济及简便DM分子生物学诊断方法,可应用DM的分子生物学诊断及鉴别诊断,推荐广泛临床应用。第二部分强直性肌营养不良临床及骨骼肌病理研究目的:强直性肌营养不良(Myotonic dystrophies,DMs)是一组以肌强直、进行性加重肌无力、肌萎缩等骨骼肌症状为主,伴白内障、早秃、心律失常、认知和行为异常、内分泌、生殖功能等多系统受累的常染色体显性遗传(Autosomal dominant,AD)骨骼肌疾病。多青春期后期起病,全球发病率2.45~5.5/10万,无明显地区及种族差异性。同一家系可有不同临床表型。电生理检查呈典型肌强直合并肌病电位,部分患者可合并周围神经受损。活检骨骼肌示典型肌源性改变,可见典型核内移、核聚集、肌浆块等结构改变。根据临床表型、致病基因分DM1及DM2两亚型,DM1四肢远端肌肌强直、肌无力、肌萎缩;DM2又称近端型强直性肌营养不良(Proximal myotonic myopathy),临床症状与DM1相似,但以肢体近端肌受累为主。本研究回顾性分析25例临床、病理及优化PCR基因检测诊断为DMs患者临床资料,总结、分析中国DMs临床表型及骨骼肌病理特点。方法1临床病例资料收集回顾性总结分析25例第一部分研究明确诊断证实为DMs患者临床病例资料。2骨骼肌病理分析全部患者签署病理诊断及分子生物学诊断知情同意书。肱二头肌开放式骨骼肌活检获取标本(1×0.5 cm),迅速异戊烷/液氮冷冻,13种常规组织化学、酶学染色(苏木精-伊红、改良Gomori三原色、还原型辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶、琥珀酸脱氢酶、单磷酸腺苷脱氨酶、细胞色素C氧化酶、三磷酸腺苷环化酶、酸性磷酸酶、过碘酸雪夫氏、油红O/苏丹黑B)。结果1 22例确诊DMs基本临床表现:电生理肌强直电位/伴少量肌病电位,美西律、卡马西平联合治疗肌强直症状显著改善。22例DM1,9例男性,13例女性,四肢远端肌起病肌无力、肌萎缩(动作笨拙缓慢僵硬),叩击性肌球(+),17/22 DM1不同程度伴心脏病(束支传导阻滞为主)、白内障(7)、甲状腺(1)、内分泌(1)、中枢神经系统受累(6);3例DM2四肢近端肌无力起病,肌球(+),临床症状轻,3例伴不同程度心脏功能异常,余系统受累(-)。2骨骼肌病理:肌源性改变,散在肌纤维变性、坏死、再生,结缔组织轻至中度增生;可见中心核、核内移、肌浆块、核聚集;部分肌纤维酶活性局灶降低,可见虫噬样肌纤维、环状肌纤维。DM1小角化散在;DM1Ⅱ型肌纤维优势、群化,DM2Ⅰ型肌纤维优势。结论1中国人群DMs中DM1发病率显著高于DM2,临床表现典型肌强直伴肌无力、肌肉萎缩,伴多系统受累“综合临床表型”,与既往DMs临床表型报道无显著差异。2 DMs骨骼肌病理分析出现上述典型病理表现可提示诊断DMs,DM1Ⅱ型肌纤维优势、群化,DM2Ⅰ型肌纤维优势。3 DM1临床及骨骼肌受累程度与(CTG)n呈正相关,核苷酸重复序列数目越多,临床表型越重,起病越早;DM2与发病年龄及病程呈正相关。第三部分非萎缩性肌强直临床及分子生物学研究目的:先天性肌强直(Myotonia Congenita,MC)及先天性副肌强直(Paramyotonia Congenita,PC)是NDMs重要亚型。与DMs相鉴别的是其由分布在骨骼肌细胞膜离子通道亚单位编码基因直接变异引起离子通道功能改变的一组先天性骨骼肌离子通道病。MC由位于7q35CLCN-1变异致病,经典MC除肌强直症状外,多伴肌容饱满,叩击性“肌球”,握拳伸直困难,“加温”现象,少数患者伴肌肉疼痛。根据遗传方式分为AD遗传—Thomsen’s肌强直(DMC)及AR遗传—Becker’s肌强直(RMC)。PC由位于17q23.1-25.3编码Na+通道的SCN4A发生变异致病。PC主要表现突发性、遇冷诱发肌强直、力弱;运动后肌强直症状加重。该亚型舌面肌、上肢远端肌群较下肢受累显著,且肌强直较力弱持续时间短。目前,该组疾病尚缺乏典型骨骼肌病理形态及生化检测改变,多通过临床表型、电生理检查与其它亚型肌强直骨骼肌遗疾病鉴别。丰富的临床/遗传异质性为其诊断、分型、治疗、预后及预防提出了难题。本研究对入选17例NDMs(包括5例先证者家系成员)进行临床、骨骼肌病理分析研究,并应用分子生物学方法明确诊断分型,初步探讨该组疾病在中国人群发病及基因变异特点。方法1病例筛选选取第一部分研究中17例DMs筛查阴性患者列入组研究。归纳整理17例入组病例临床资料,包括:性别、发病年龄、家族史(遗传方式)、叩击性“肌球”(±)、握拳伸直(±)、“加温”现象(±)、肌力、肌容受累肌群、跟腱挛缩(±)、其它系统受累情况、肌酸激酶(CK)、电生理检查、治疗情况等。2活检骨骼肌病理分析,同第一部分。3 基因检测应用Primer 5软件进行PCR反应引物设计,覆盖CLCN-1、SCN4A、KCNE3、CACNA1S基因全长,包括23个外显子、24个外显子、3个外显子、44个外显子及内含子交界区。进行相关致病基因变异位点检测。结果1研究基因分析CLCN-1检测阳性率47%(8/17),新发7个致病基因位点集中分布在8、12号外显子区域;SCN4A检测阳性率29%(4/17),新发3个致病位点集中分布在22、24号外显子区域。根据基因分型临床诊断:8例先证者明确诊断MC(1例DMC);4例先证者明确诊断PC;MC发病人群显著高于PC。2 NDMs多5-10岁起病,临床以肌强直为主症,电生理呈肌强直电位,极少伴肌病电位,患者有继发跟腱挛缩、脊柱侧弯现象,部分伴心功能异常。给予卡马西平及美西律联合治疗肌强直症状可得到显著缓解。3 17例NDMs活检骨骼肌肌源性改变,未发现特异性病理结构改变,部分重症患者可见肌细胞变性、坏死、再生,酶活性局灶降低,散在小角化肌纤维(Ⅰ型为主)。9例MC出现ⅡB肌纤维缺如,该特点可用于MC及PMC鉴别诊断。与DMs相区别:NDMs无特异性结构改变及活跃肌纤维变性、坏死、结缔组织重度增生等强直性肌营养不良病理改变,提示活检骨骼肌病理分析有助于强直性肌营养不良与非萎缩性肌强直鉴别诊断,但并能作为该组疾病诊断的金标准。结论1基因检测分析是NDMs诊断及分型诊断的金标准;NDMs涉及致病基因多,二代测序技术的推广能更好用于该组疾病的诊断与分型诊断。2中国人群存在新发CLCN-1/SCN4A致病突变位点,上述致病位点目前尚无数据库报道,扩大了上述基因致病谱。