目的:本文通过制备中药复方制剂丹柴合剂的含药血清,研究丹柴合剂对调节性树突状细胞(regulatory dendritic cells,DCregs)的诱导分化作用和对小鼠皮肤移植模型的影响,进而探究丹柴合剂的免疫耐受作用及其分子机制。方法:1.用血清药理学方法制备丹柴合剂含药血清,-80℃冻存,体外实验备用。用免疫磁珠法分离人外周血单个核细胞,培养至第5～7天获得未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs),经丹柴合剂含药血清作用48h后流式检测树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型CD11b、CD86和人白细胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR,HLA-DR)。2.收集人外周血imDCs,经丹柴合剂含药血清作用48h后,用transwell试验检测DCs的迁移作用,用流式细胞仪检测DCs的吞噬作用以及DCs介导的抗原特异性CD4~+T细胞增殖作用,用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的分泌。3.收集人外周血imDCs,经丹柴合剂含药血清作用48h后,用Annexin V和propidium iodide溶液避光孵育细胞20min,用流式细胞仪检测细胞凋亡。4.建立小鼠皮肤移植模型,于皮肤移植术前3天给予BALB/c小鼠灌胃含丹柴合剂水提物的PBS缓冲液(体积:18 g/kg)直至移植术后第14天,对照组给予同等体积的PBS缓冲液。术后每日观察皮片的生长情况,并记录皮片存活时间。移植术后第21天提取小鼠肝、肾组织做病理分析,提取小鼠血清,检测肝肾功能指标。5.收集人外周血imDCs,经丹柴合剂含药血清作用48h后,用蛋白质免疫印迹(Western-blot)技术和荧光实时定量PCR检测吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)基因的表达。结果:1.流式检测经丹柴合剂含药血清作用后的DCs表型,发现丹柴合剂可使共刺激分子CD86、抗原提呈分子HLA-DR表达降低,还可使DCregs特异性分子CD11b表达增强,提示丹柴合剂可将DCs诱导分化为DCregs。2.流式检测经丹柴合剂作用后的DCs免疫学功能,发现丹柴合剂可抑制DCs的迁移作用以及DCs介导的抗原特异性CD4~+T细胞增殖作用,提示丹柴合剂可诱导DCregs发挥免疫耐受作用。此外,ELISA实验显示丹柴合剂可促进DCs高表达细胞因子IL-10与TGF-β。3.细胞凋亡实验表明,丹柴合剂对DCs的凋亡无影响,这进一步证实丹柴合剂对DCs免疫功能的抑制作用是其对DCs诱导分化为DCregs的结果。4.成功建立小鼠皮肤移植模型。术后监测发现丹柴合剂可显著延长小鼠皮片存活时间,并有效缓解皮片排斥情况。此外,小鼠肝、肾组织病理分析与肝肾功能化验结果显示丹柴合剂对小鼠无毒性反应。5.丹柴合剂可诱导DCs高表达IDO,提示丹柴合剂是通过TGF-β促进IDO高表达,从而诱导DCregs发挥免疫耐受作用。结论:丹柴合剂可诱导DCs分化为DCregs,并发挥免疫耐受作用,有望成为一种高效、无毒的新型免疫抑制剂,用于治疗过敏反应、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病等免疫相关性疾病。