目的：研究链脲佐菌素(streptozotocin ,STZ)诱导的糖尿病胃轻瘫大鼠(disbetic gastroparesis , DGP)胃平滑肌细胞大电导钙激活钾通道( large conductance calcium-activated potassium channels, BKCa)的变化,探讨糖尿病胃轻瘫的病理机制与胃平滑肌细胞 BKCa通道的关系,为探索新的药物和治疗方法提供实验依据。 方法：1.动物分组及造模：健康纯系雄性SD大鼠50只,随机分为对照组和模型组。模型组用0.1mmol/L柠檬酸缓冲液配制的2% STZ 60mg/Kg一次性腹腔内注射,3日后禁食不禁水6h,采尾血测空腹血糖,以血糖持续一周≥16.9mmol/L为糖尿病造模成功；对照组用0.1mmol/L柠檬酸缓冲液2ml/Kg一次性腹腔内注射,两组均给予标准鼠饲料继续喂养。10周后测量大鼠空腹血糖及体重,将1 mg/ml美蓝溶液0.4ml灌胃,30min后处死大鼠,将胃内残留物用4ml生理盐水冲洗并收集冲洗液,离心取上清液,用722分光光度计在640nm波长检测吸光度值(OD),测量胃内色素残留率。血糖≥16.9mmol/L伴胃排空速率显著下降表明 DGP 造模成功。2.急性酶分离 SD 大鼠胃平滑肌细胞：将大鼠禁食不禁水24h后处死,开腹取胃,剪开胃部,用无钙生理溶液漂洗干净,体式显微镜下剥下肌层,沿肌条方向剪成1mm×3 mm的组织条块,置于低钙生理溶液中保存20分钟后放入木瓜蛋白酶酶液,于37℃恒温水浴箱中振荡消化15min,在显微镜下找到10个左右细胞/低倍视野(10×10),且细胞膜完整光滑,折光性好,即可终止酶解,置于 4℃冰箱中保存备用。3.单通道膜片钳技术记录大鼠胃平滑肌细胞 BKCa通道电流：选择贴壁良好、胞膜完整和折光性好的细胞进行实验。操纵微推进器使电极尖端贴附在细胞表面,采用细胞贴附式膜片(cell-attached patch)和内面向外式膜片(inside-out patch)记录BKCa电流。采样频率为10 kHz,方式为Gap Free,时间为30秒。记录数据由pClamp 6.0软件储存,用Clampfit 10.1软件分析,Origin8.0软件进行直线拟合与绘图。4.免疫组织化学技术测定 BKCa通道蛋白 KCNMA和 KCNMB1 的表达：将胃组织固定、脱水、透明、包埋,用 Leica2245 切片机进行切片。按抗体说明书操作步骤进行免疫组织化学检测。采用OLYMPUS 1X71光学照相系统拍照,Image-Pro-Plus6.0软件进行图形数据分析。 结果：1.模型组大鼠体重(190±23.71 g)明显低于对照组(428±25.05 g), P<0.01。模型组大鼠平均血糖浓度(30.26±2.19mmol/L)显著高于对照组(4.83±1.09 mmol/L),P<0.01。胃内色素残留率反映了胃排空情况,模型组大鼠胃内色素残留率(54.50%±3.92%)明显高于对照组(4 0.69%±3.55 %),P<0.01。以上结果提示大鼠DGP造模成功 2. 急性酶分离的SD大鼠胃平滑肌细胞多呈梭形,细胞核规则,细胞膜完整,折光性强,数量多,能满足膜片钳实验需要。 3. SD大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道单通道电流鉴定及特性：①在内面向外式膜片下,膜电位(Vm)为+30 mV,于浴液中加入200 nmol/L BKCa通道特异性阻断剂 IbTX,膜片单通道电流被阻断。②膜片单通道电流电导值为211.7±13.6 pS,具有大电导的特性。③膜片单通道电流图形具有明显的电压依赖性和细胞胞浆面钙离子浓度依赖性,浴液中游离Ca2+浓度分别为0,10-7,5×10-7,10-6 nM时, 开放概率(Open Probability,NPO)分别为0.018±0.007,0.0482±0.013,0.156±0. 017,0.506±0.019。综合以上实验结果,所记录的单通道电流符合BKCa通道特性,为BKCa通道单通道电流 4. 对照组大鼠胃平滑肌BKCa通道单通道电流与模型组对比：在细胞贴附式膜片下(Vm=+40mV),对照组BKCa通道N PO为0.018±0.006、电流幅值(amplitude of current,Amp)为7.9298±0.77 8 pA、平均开放时间(the mean open time,TO)为17.642±5.651 ms、平均关闭时间(the mean close time,TC)为578.857±203.829 ms；模型组BK Ca通道开放概率为0.058±0.014、电流幅值为8.641±0.673、平均开放时间为4. 814±2.639、平均关闭时间为276.785±116.530。与对照组比较,模型组大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道开放概率显著上升(t=9.294,P<0.01),电流幅值增加(t=2.592,P=0.015),通道平均开放时间减少(t=7.965,P<0.01),平均关闭时间减少(t=4.814,P<0.01),差异具有统计学意义。 5. 免疫组织化学技术检测KCNMA蛋白与KCNMB1蛋白表达：对照组KCNMA蛋白表达光密度值(Inte grated Optical Density,IOD)为13558.2±2216.5,KCNMB1蛋白表达IOD值为525875.5±65718.1；模型组KCNMA蛋白表达IOD值为29801.6±3123.1,K CNMB1蛋白表达IOD值为493504.6±27916.2。与对照组比较,模型组SD大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道KCNMB1蛋白表达增加(t=9.484,P<0.01),差异具有统计学意义；KCNMA蛋白表达无明显变化(t=1.014,P=0.334),差异不具有统计学意义。 结论：1.膜片钳实验记录的胃平滑肌细胞单通道电流为 BKCa通道单通道电流,具有大电导、电压依赖性、钙离子浓度依赖性等特性。2.在细胞贴 附式膜片上,DGP大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道单通道电流开放概率增加,开放幅度上升,功能活动增强,DGP发病与BKCa通道功能活动增强相关。3.DGP大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道KCNMB1蛋白表达上调,胃轻瘫大鼠BKCa通道功能活动增强与β1亚基表达上调有关。