日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV),简称乙脑病毒,属于单股正义链RNA病毒,病毒基因组较小,病毒结构较为简单,必须利用宿主蛋白完成自身复制增殖。前期研究发现宿主蛋白锌指蛋白ZNF251与α2巨球蛋白α2M是病毒NS1蛋白的潜在互作蛋白,CRBN蛋白、蛋白磷酸酯酶PPP2CB与腓骨蛋白FBLN-5是病毒NS3的潜在互作蛋白。本研究旨在验证上述宿主蛋白对乙脑病毒的复制增殖是否有影响,进一步揭示宿主蛋白在乙脑病毒增殖与复制中发挥的作用。首先,构建针对上述蛋白的293单基因敲除细胞系。研究中成功运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建针对ZNF251、α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5和HSP70的293单基因敲除细胞系,并通过测序和Western Blotting鉴定正确;之后,发现ZNF251基因的缺失正向调节了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平,而除HSP70外的其他基因的缺失对JEV的mRNA和子代病毒粒子水平无影响。使用反转录荧光定量和噬斑形成实验,发现在敲除ZNF251基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平约为对照组的2.4倍,而在敲除除HSP70外的其他基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平与对照组的差异不显;敲除ZNF251基因的293细胞接种JEV后,子代病毒滴度平均值约为lg8.67 PFU/ml,高于对照的lg7.80 PFU/ml,而在敲除除HSP70外其他基因的293细胞上,子代病毒滴度平均值与对照组差异不明显。综上结果证实了CRISPR/Cas9可以成功运用在293细胞上进行基因编辑并进行JEV的相关研究,并通过在各敲除细胞系上的研究,筛选出293细胞的宿主蛋白ZNF251是一种对JEV的增殖与复制有影响的宿主蛋白,ZNF251可能对JEV在293细胞中的复制增殖有一定的抑制作用,而α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5基因对于JEV在293细胞中的复制增殖无明显影响。