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慢性脑灌注不足（chronic cerebral hypoperfusion,CCH）是血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment,VCI）发生和发展的过程中的关键因素。大量增加的谷氨酸与广泛分布于中枢神经系统突触后膜的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）结合,诱发兴奋性毒性,导致神经元凋亡,突触可塑性降低,损伤认知功能。激活素A（Activin A,Act A）可以促进NMDAR磷酸化,课题组前期研究结果表明,外源性Act A可能通过抗凋亡作用减轻缺血缺氧过程中发生的神经元损伤。NMDAR激活后可以介导下游经典Wnt信号通路（即Wnt/β-catenin信号通路）的启动,参与突触可塑性的调节。丰富环境（enriched environment,EE）是一种经典的积极环境效应模型,既往研究证实丰富环境可以改善多种疾病引起的认知功能障碍,影响NMDAR表达,增强突触可塑性,但其机制是否通过调控Act A、NMDAR、Wnt/β-catenin信号通路的表达改善血管性认知功能障碍尚不明确。因此,本研究为明确丰富环境对血管性认知功能障碍的影响以及Act A/NMDAR-Wnt信号转导在这一过程中的作用机制,为临床改善血管性认知功能障碍患者的预后提供新的思路。1.丰富环境改善血管性认知功能障碍损伤目的:探讨丰富环境对血管性认知功能障碍损伤的改善作用。方法:SPF清洁级SD大鼠随机分为慢性脑低灌注模型+标准环境组（CCH组）、假手术+标准环境组（Sham组）、慢性脑低灌注模型+丰富环境组（EE组）。EE组与CCH组用双侧颈总动脉结扎（2-vessel occlusion,2-VO）法建立CCH模型,模拟VCI的发生过程,Sham组只分离不结扎双侧颈总动脉。EE组饲养于丰富环境中,CCH组与Sham组饲养于标准环境中,分别于4、8周Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,HE染色观察神经元损伤,TUNEL染色检测神经元凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平。结果:缺血发生4W后,CCH组大鼠与EE组相比,逃避潜伏期明显延长,8W后这种差异更加显著,说明大鼠认知功能下降,丰富环境可以改善认知功能;EE组与CCH组相比,神经元损伤明显减轻,部分神经元的细胞形态得到恢复,神经元的变性和坏死程度有所改善,神经元凋亡明显减少,8W后神经元凋亡率比4W组更高;EE组与CCH组相比,Bcl-2/Bax相对表达水平上调,8W后上述改变更加显著。结论:丰富环境可以影响凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达,减少神经元凋亡,改善血管性认知功能障碍脑损伤。2.丰富环境通过诱导Act A改善血管性认知功能障碍认知功能目的:探索丰富环境干预后,Act A对VCI大鼠钙内流、NMDAR、Wnt/β-catenin信号通路表达的影响。方法:使用钙离子探针作为一抗标记细胞内Ca2+,添加荧光标记的二级抗体,检测神经元内钙离子含量变化。利用免疫荧光染色和Western blot检测海马及前额叶皮层神经元Act A、NMDAR相关亚基（NMDAR、NR2A和NR2B）、突触相关蛋白（GAP43、SYN、PSD-95和MAP-2）以及Wnt/β-catenin信号通路（Wnt3a、β-catenin、VEGF、Cyclin D1、GSK-3β和p-GSK-3β）的表达水平变化。高尔基染色观察神经元的树突结构改变。在此基础上建立丰富环境+CCH+Act A抑制剂FSH组（EEF组）,再通过免疫荧光染色检测Ca2+和Act A表达变化,Western blot检测Act A、NMDAR、NR2A、NR2B、GAP43、SYN、PSD-95、MAP-2、Wnt3a、β-catenin、VEGF、Cyclin D1、GSK-3β和p-GSK-3β的表达变化。结果:EE组大鼠与CCH组大鼠相比:额叶皮层及海马神经元Ca2+的浓度降低,Act A浓度升高;NMDAR相关亚基和突触相关蛋白的表达水平升高;额叶皮层和海马神经元树突棘密度显著增加。EEF组大鼠与EE组大鼠相比,Act A表达下调,NMDAR、NR2A、NR2B表达水平降低,Ca2+含量增加。GAP43、SYN、PSD-95、MAP-2、Wnt3a、β-catenin、VEGF和Cyclin D1的表达下调,p-GSK-3β表达上调。EEF组与EE组相比,神经元树突棘的头部体积减小,颈部被拉长,树突棘密度降低。结论:丰富环境通过诱导Act A促进NMDAR和Wnt/β-catenin信号通路激活,提高血管性认知功能障碍大鼠神经元突触可塑性。3.丰富环境通过NMDAR-Wnt信号转导与Act A的正反馈环路改善血管性认知功能障碍损伤目的:探讨丰富环境改善突触可塑性中NMDAR及Wnt/β-catenin信号通路的作用,明确丰富环境改善认知功能中NMDAR-Wnt信号转导与Act A的调控机制。方法:利用免疫荧光染色检测神经元内Ca2+水平。Western blot检测海马及前额叶皮层神经元Act A以及突触相关蛋白（GAP43、SYN、PSD-95和MAP-2）的表达水平变化。高尔基染色观察树突结构变化。在此基础上建立丰富环境+CCH+NMDAR阻断剂MK801组（EEM组）和丰富环境+CCH+Wnt/β-catenin信号通路阻断剂Dic KKopf-1组（EED组）,Morris水迷宫明确NMDAR对大鼠学习记忆能力的影响,免疫荧光染色检测Ca2+变化,Western blot检测Act A、GAP43、SYN、PSD-95和MAP-2的表达变化。结果:EEM组与EE组相比:逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,大鼠的学习和记忆功能损伤加重;Act A表达下调,Ca2+含量增加;GAP43、SYN、PSD-95和MAP-2的表达下调,神经元树突棘密度降低。EED组大鼠与EE组大鼠相比:GAP43、SYN、PSD-95和MAP-2的表达下调,突触可塑性降低。结论:丰富环境改善血管性认知功能障碍损伤过程中存在Act A和NMDAR-Wnt信号转导的正反馈环路。