心肌纤维化是在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚或胶原成分发生改变,是病毒性心脏病(包括急、慢性心肌炎和部分扩张型心肌病)特征性病理变化,过度的心肌纤维化是病毒性心脏病出现心律失常、心力衰竭、心脏性猝死等并发症以及由心肌炎发展到心肌病的决定因素,但其发生机制尚未完全阐明。本研究致力于探讨心肌纤维化在病毒性心脏病不同阶段的发生机制并寻求有效的药物干预手段。全文共分为以下四部分: 第一部分:病毒性心脏病动物模型的建立目的 建立急、慢性心肌炎和扩张性心肌病系列动物模型。 方法 Balb/c 小鼠120 只,随机分为 3 组,分别 7 天组(n=30)、三月组(n=40)和 9 月组(n=50)。从每组中任选 10 只,腹腔注射 Eagel’s 病毒培养液(EMEM),作为正常对照;其余小鼠均以柯萨奇病毒 B3 腹腔注射制作急、慢性心肌炎和扩张型心肌病动物模型;分别于接种后第 7 天、第 3 月和第 9 月对各组 (对照组和模型组) 小鼠行心脏超声检查;其后杀鼠取心脏作组织学和形态学检查,提取血清样品作后续生化检测。结果 第 7 天感染小鼠心肌细胞变性坏死、间质有大量炎性细胞浸润;第 3 月感染小鼠心肌内炎性细胞浸润减少,心肌间质纤维化明显,心脏收缩功能减退;第9 月小鼠心肌间质弥漫性纤维化而无炎性浸润, 心脏收缩功能明显减退、心腔扩张。 结论 以柯萨奇病毒 B3 感染 Balb/c 小鼠成功建立了急、慢性心肌炎和扩张型心肌病。关键词:心肌炎;扩张型心肌病;柯萨奇病毒 B;模型 第二部分:病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制研究目的 探讨病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制。 方法 对各期病毒性心脏病模型组以及对照组小鼠心脏切片行胶原特异的苦味酸天狼星红染色,计算胶原容积积分;以酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠血清 III 型前胶原氨基端前肽(PIIINP)、I 型前胶原氨基端前肽(PINP)和 I 型前胶原羧基端前肽(PICP);以免疫印迹增强化学发光法(Western Blot ECL)检测各组小鼠心肌中致纤维化细胞因子(TGFβ1 和 PDGF-B)、胶原酶及其组织抑制物(MMP1/TIMP1、MMP13 1 复旦大学博士论文. 2004<WP=5>病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物干预研究中文摘要和 MMP14)、醛固酮合成酶(CYBIIB2)和 11β羟类固醇脱氢酶(11β-HSD)的表达;以微矩阵基因芯片分析各组小鼠心肌组织中非胶原细胞外基质(ECM)基因的表达变化,其后以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法验证芯片筛选结果;以缺口末断标记(TUNEL)法检测各组小鼠心肌细胞凋亡,其后以小鼠细胞凋亡专用基因芯片检测凋亡相关基因的表达变化。 结果 组织学和血清学检测结果显示:急性期胶原的合成和分解同时增强,为修复性纤维化;慢性期是修复性纤维化与反应性纤维化并存,胶原合成增多而降解减少;心肌病期主要是反应性纤维化,胶原合成亢进。致纤维化细胞因子 TGF-β1 在各期病毒性心脏病小鼠心肌中表达上调;另一个致纤维化细胞因子 PDGF 在病程中无变化。心肌局部醛固酮合成酶(CYP11B2)在感染急性期即表达增多,慢性期和心肌病期其表达上调更加显著,提示心脏局部 RAS 系统可能对病程起重要作用;11β类固醇脱氢酶(11β-HSD)对病程无影响。MMP-1 的表达量随病程进行性减少,而 TIMP-1表达量在病程中无变化,MMP-1/TIMP-1 比例进行性下降;MMP13 的表达随病程逐渐增多;MMP14 在感染早期表达上调,慢性期和心肌病期无变化。基因芯片和 RT-PCR 检测证实, 急性期有 5 个非胶原性 ECM 基因表达异常增高,其中有 ILK 和 Lamr1 是肿瘤相关基因,ADAMTS1 与炎症和肿瘤侵袭均有关的基因,Fin15 与 Itgb1bp1 的功能需要进一步确定;细胞凋亡贯穿病毒性心脏病全程,凋亡专用基因芯片发现多个凋亡相关基因在病程中异常表达。 结论 心脏局部微环境发生重大变化是病毒性心脏病发生心肌纤维化的原因, 这些变化包括心脏局部 RAS 功能紊乱,致纤维化细胞因子、胶原酶、非胶原性 ECM 异常表达,细胞凋亡活跃等。关键词:心肌纤维化;胶原酶;基因芯片;细胞凋亡;细胞外基质 第三部分:黄芪甲甙对病毒性心肌炎心肌纤维化的影响目的 观察黄芪甲甙对急、慢性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响并探讨其作用机理。 方法 研究分为急性期和慢性期干预两部分。急性期:Balb/c小鼠 100 只,随机分成 6 组。非感染小鼠腹腔注射病毒培养液,分为正常对照(A组,12 只, 以生理盐水灌胃 7d)、高剂量黄芪甲甙对照组(B组,16 只, 黄芪甲甙 0.6 mL/kg.d-1灌胃 7d);余 72 只小鼠以柯萨奇病毒(CVB3)腹腔注射制作病毒性心肌炎模型,感染小鼠分别为心肌炎对照组和低、中、高剂量黄芪甲甙干预心肌炎组,分别以生理盐水和低、中、高剂量(0.07, 0.2, 0.6 mL/kg.d-1)黄芪甲甙灌胃 7d (分别为C、D、E、F组,每组 18 只)。14d后处死小鼠,以ELISA法检测血清胶原前肽(PICP、PINP和PIIINP)浓度,心脏组织用天狼星红染色后测定胶原容积积 2 复旦大学博士论文. 2004<WP=6>病毒性心脏病心肌纤维化的发生机制及其药物干预研究 中文摘要分(CVF),以流