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第一部分 重组人血小板生成素对32D细胞、间充质干细胞体外作用及机制研究目的探讨重组人血小板生成素(rhTPO)对经再生障碍性贫血(AA)患者血清处理后的小鼠32D细胞及大鼠骨髓间充质干细胞的体外作用及可能作用机制,以阐明其治疗再障的机制。方法(1)用CCK8法及台盼蓝活细胞计数实验验证不同浓度rhTPO(50u/ml、100u/ml、150u/ml和200u/ml)对稳定转染rhTPO受体(32D-MPL)的32D细胞增殖能力的影响,得到rhTPO促进32D细胞增殖能力的最佳浓度;(2)将32D细胞分成4组:①空白对照组(32D细胞+正常FBS血清);②AA组(32D细胞+正常FBS血清+再障血清);③rhTPO对照组(32D细胞+正常FBS血清+rhTPO);④rhTPO组(32D细胞+正常FBS血清+再障血清+rhTPO);大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分成3组:①正常BMSC;②AA组(正常BMSC+AA血清);③rhTPO组(正常BMSC+AA血清+rhTPO),用CCK8法及台盼蓝染色法检测不同培养条件下的细胞的增殖能力及生长曲线;(3)用Annexin V-FITC标记各组32D细胞和大鼠BMSC细胞,并用流式细胞仪分析,检测AnnexinV+/PI-比例,了解细胞凋亡情况;(4)用流式细胞仪检测不同培养条件下的对数生长期大鼠BMSC的细胞周期;(5)用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测抗凋亡基因Survivin和BCL-2及促凋亡相关基因BAX以及基因Bcl-xl、c-myc的mRNA的表达;(6)用免疫印迹法(Western-blot)检测STAT3、STAT5、抗凋亡基因Survivin和BCL-2、促凋亡相关基因BAX及Bcl-xl、c-myc的蛋白表达;同样的方法检测不同组别的大鼠BMSC的c-MPL的蛋白表达。结果(1)经再障血清处理后的32D细胞凋亡率明显升高,显著抑制32D细胞增殖,加入rhTPO能降低细胞的凋亡率,促进32D细胞增殖,但rhTPO无法使其恢复到正常血清组细胞的增殖水平;(2)再障血清组32D细胞内的STAT3蛋白磷酸化水平高于正常血清组,STAT5蛋白磷酸化表达水平明显低于正常血清组;经rhTPO处理后再障血清组STAT3蛋白磷酸化水平下调,STAT5蛋白磷酸化水平上调,差异均具有统计学意义。(3)再障血清组32D细胞抗凋亡基因Survivin和BCL-2的mRNA及蛋白水平明显下降,经rh,IPO处理后mRNA及蛋白表达水平均显著上调(P<0.05);再障血清组32D细胞促凋亡基因BAX的mRNA及蛋白水平明显上升,经rhTPO处理后mRNA及蛋白表达水平均显著下调(P<0.01);相对于正常血清组,rhTPO处理后正常血清组32D细胞BAX蛋白表达水平明显下调(P<0.05),而mRNA水平无明显变化;(4)再障血清培养大鼠BMSC细胞,加rhTPO刺激后促进BMSC增殖及表面c-MPL的表达,并能抑制细胞凋亡,且具有统计学意义。结论(1)32D细胞经再障血清处理后,凋亡率明显增加,加入rhTPO能逆转32D细胞的凋亡率,促进32D细胞增殖,但无法使再障血清组细胞恢复至正常血清组细胞增殖水平。(2)rhTPO作用于再障血清组32D细胞,可上调抗凋亡基因(Survivin、BCL-2)mRNA及蛋白表达水平;并下调促凋亡基因(BAX)mRNA及蛋白表达水平,两者差异均有统计学意义;(3)rhTPO可促进AA血清培养后大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及c-MPL的表达,抑制细胞凋亡。第二部分 rhTPO联合激素及环孢素A治疗免疫相关性血细胞减少症20例近期疗效及安全性目的评价重组人血小板生成素(rhTPO)联合激素及环孢素对免疫相关性血细胞减少症(IRH)近期疗效及安全性的影响。方法回顾性分析激素及环孢素联合rhTPO治疗20例成人IRH患者,以同期单用标准激素及环孢素方案的14例患者为对照组,比较两组患者血液学反应及血小板恢复情况,以及安全性评价。结果治疗后2周,rhTPO组患者血小板升高较对照组明显(P<0.05);治疗后6周,rhTPO组患者血红蛋白较对照组升高明显(P<0.05);rhTPO组患者脱离血小板输注时间较对照组短。治疗4周后,rhTPO组与对照组脱离血小板输注时间无统计学差异,rhTPO联合治疗组在治疗后2周、4周、6周红细胞输注量的差异无统计学意义,而治疗后8周的红细胞输注量有统计学差异,治疗后3个月及6个月,rhTPO组患者与对照组患者血液学反应无明显统计学差异。结论rhTPO提高IRH的早期血液学反应率,加快血小板恢复,且安全性高。