研究背景:阿尔茨海默症是一种神经退行性病变,主要病理表现为神经元细胞外淀粉样斑块沉积、神经元细胞内Tau蛋白高度磷酸化的神经纤维缠结以及神经细胞和突触数量减少。致病原因尚不明确,但Aβ假说被广泛认同,即Aβ的胞外聚集为阿尔茨海默症的主要发病原因。随着该假说的不断发展,现认为Aβ寡聚体最具毒性也是致病的最基本原因,Aβ在阿尔茨海默症患者脑中聚集,形成老年斑。在细胞水平上来说是Aβ于胞外沉积,使细胞内离子紊乱,环境稳态失衡,导致细胞凋亡。细胞凋亡的途径包括线粒体功能发生障碍,线粒体膜电位降低,膜通透性增强,导致活性氧释放增多,与细胞凋亡相关的蛋白表达有所变化,促凋亡蛋白表达上调,抗凋亡蛋白表达下调。提示Aβ损伤细胞可能通过损伤线粒体功能进而造成细胞凋亡。Aβ寡聚体由APP蛋白裂解而成,常见寡聚体有AβI-40及Aβ1-42,本实验采用Aβ25-35片段,Aβ25-35片段为Aβ1₄2有效片段,且具备细胞毒性。开心散始见与唐代孙思邈《备急千金要方》,经近代药理研究,是治疗抑郁症等疾病的基础药物。开心散的药物组成人参、远志、石菖蒲及茯苓亦是治疗阿尔茨海默症的高频药物,进而提示开心散可以作为治疗阿尔茨海默症药物进行研究。中医认为,阿尔茨海默病的病因病机为“肾虚髓亏为本,痰瘀阻滞为标”,五脏失调,脑髓失用。传统的中药药理体外研究采用直接给药方法,但由于中药及中药复方成分复杂,以及直接给药法难以模拟体内真实环境,故提出血清药理学方法,即将中药或中药复方给动物灌服,取动物血清作为药物源进行体外实验。血清药理学方法弥补了直接给药法的不足,为中药药理的体外研究提供了新的思路。基于以上研究背景,现探讨开心散含药血清是否对Aβ25-35造成的神经细胞损伤有保护作用,且初步探讨其保护作用机制,即是否通过保护线粒体功能而发挥作用。目的:本实验通过Aβ25₃5损伤人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为研究模型,采用血清药理方法探讨开心散是否具有神经保护作用,并初步探讨可能的机制。方法:大鼠随机分为四组,分别连续灌服开心散药粉三个剂量（0.58g/Kg,1.16g/Kg,2.32g/Kg）及等量蒸馏水,连续7天,灌药量10mL/kg,每天2次。于第8日给药后1h经腹主动脉取血,静置离心,制备血清,灭活,以开心散含药血清为药物源进行实验。高效液相色谱-质谱联合检测含药血清中药物有效成分情况;SH-SY5Y细胞预先用空白鼠血清及含药鼠血清培养细胞2h,给予10μmol/LAβ25-35处理24h,然后按各实验操作进行指标检测。为探讨开心散对神经细胞的保护作用及可能的机制,采用MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-PI染色,激光共聚焦显微镜拍照,流式细胞仪检测凋亡率检测细胞凋亡情况;激光共聚焦显微镜拍照,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化;荧光倒置显微镜拍照,流式细胞仪检测细胞内活性氧水平;Western Blot检测Bcl-2、BAX、Caspase-3、Akt1/2/3 及p-Akt 蛋白表达水平;结论:Aβ25₃5可通过损伤线粒体来启动细胞凋亡,最终导致神经细胞损伤。开心散可以针对线粒体,维持其内稳态,对抗细胞凋亡,从而对Aβ25-35造成的细胞损伤起到保护作用。结果:经高效液相色谱-质谱联用技术对开心散含药血清的检测中,经一级质谱图推测开心散含药血清中包括 sibiricose A5, sibiricose A6, tenuifoliside B, tenuifoliside C,tenuifolisideD,β-细辛醚,人参皂苷Rb1,人参皂苷Rh1,茯苓新酸B,茯苓新酸DM,茯苓新酸D等十种有效成分。通过实验条件筛选,Aβ25₃5损伤浓度为10μmol/L,细胞培养液构成为RPMI1640培养液、10%鼠血清及1%青霉素-链霉素混合溶液。且空白鼠血清及含药鼠血清对细胞没有损伤作用。MTT比色法探讨开心散含药血清对Aβ25-35所致SH-SY5Y细胞活力影响,结果显示,Aβ25₃5可显著降低细胞活力,而开心散可有效对抗损伤。细胞凋亡检测结果表示,Aβ25₃5可提高SH-SY5Y细胞凋亡率,开心散可显著降低凋亡率,抑制凋亡。活性氧检测结果显示,Aβ25-35处理后,细胞内活性氧处于高表达水平,开心散可降低细胞内活性氧水平。线粒体膜电位检测中,Aβ25-35可损伤线粒体功能,造成线粒体膜电位下降,开心散可使细胞膜电位维持相对正常的水平。Western Blot检测 Bcl-2、BAX、Caspase-3、Akt1/2/3 及 p-Akt 蛋白表达情况,Aβ25-35 可下调 SH-SY5Y细胞Bcl-2蛋白表达,p-Akt蛋白表达比率下降,上调BAX及Caspase-3蛋白表达,而开心散则可以通过增加p-Akt蛋白表达比率,上调Bcl-2蛋白表达,下调BAX及Caspase-3蛋白表达来抑制凋亡,保护细胞。